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目的 研制布氏菌病新型疫苗,为安全、有效的预防布氏菌病奠定基础。 方法 采用基因重组技术分别克隆编码布氏杆菌保护性抗原OMP16、L7/L12、BCSP31和P39的DNA片段以及OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12和P39-L7/L12的融合DNA片段,继而分别构建于原核表达载体pET32a(+)并转化于大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导各重组蛋白的表达,进一步经亲和层析法对各重组蛋白抗原进行纯化。同时将以上所克隆的各DNA片段分别构建于真核表达载体pcDNA3.1(+),并转染于COS-7细胞,经免疫细胞化学法证实各目的蛋白在细胞中的表达。最后,用所制备的布氏菌病单价、双价候选DNA疫苗及重组蛋白疫苗分别免疫Balb/c小鼠,检测其免疫应答水平;用布氏杆菌强毒株0A544对免疫后的小鼠进行攻击试验,观察候选疫苗的免疫保护效果。 结果 (1)所克隆的各DNA片段(除P39 DNA片段外)均与Genbank中的相应DNA序列一致。重组蛋白OMP16、L7/L12、BCSP31、P39、OMP16-L7/L12、BCSP31-L7/L12及P39-L7/L12在原核和真核细胞中均获得了表达。对原核系统表达的各重组蛋白进行了纯化。 (2)用各纯化的重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠后,在小鼠血清中均可检测特异性抗体,效价分别高达1∶6,400—1:25,600之间,且双价重组蛋白所诱导产生的抗体效价高于单价,表明各重组蛋白均可激发良好的体液免疫,但没有诱导出明显的细胞免疫。攻毒试验表明重组蛋白所激发的这种免疫不能对布氏杆菌强毒株A544的攻击产生明显的保护力。 (3)用布氏菌病单价候选DNA疫苗免疫Balb/c鼠后,小鼠产生了有效的特异性体液免疫和细胞免疫。抗体亚型分类表明特异性IgG1/IgG2a小于1,说明产生了Th1型为主的免疫应答。T淋巴细胞增殖试验证实免疫小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强;ELISPOT分析表明疫苗免疫组的特异性活化的可分泌IFN-γ的CD8~+T