论文部分内容阅读
2.甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)是17β-雌二醇在体内的生理代谢产物,它具有抑制多种肿瘤细胞生长和抗血管生成的活性,但作用机制尚不明确。本文以食管癌EC9706细胞系为对象,研究2-ME对EC9706细胞的生长抑制和诱导凋亡效果,并初步考察其作用机制。1.2-ME对EC9706细胞增殖及凋亡的影响EC9706细胞系分别经0.1,0.5,1,2,5,10μmol/L 2-ME处理24,48和72h后进行生长抑制分析。MTT法检测其对EC9706细胞的生长抑制效果,结果以实验组细胞存活百分比表示。数据显示,1-10μmol/L 2-ME可不同程度抑制EC9706细胞生长,并呈现出一定的时问和剂量依赖性,其中5μmol/L和10μmol/L 2-ME处理72h后细胞存活率分别为50.03%和40.33%,2-ME分别处理48h和72h后对EC9706细胞系的IC50分别为5.37μmol/L和4.14μmol/L。倒置显微镜观察细胞形态,发现2-ME作用后细胞出现变圆,皱缩,细胞间隙增大等预示其凋亡的形态变化。流式细胞术PI单染法分析细胞周期变化显示,2-ME可将细胞周期阻滞于G2/M期,用10μmol/L药物处理24h后细胞G2/M期比例达到98.70%,且S期和G1期比例明显减少。Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡,结果显示：在相同时间内随着药物浓度的升高,细胞早期和晚期凋亡比例也分别增加,经5μmol/L和10μmol/L 2-ME处理24h细胞早期和晚期凋亡比例分别为2.26%和6.41%,9.41%和19.74%,表明2-ME可抑制EC9706细胞的生长,诱导其凋亡,并可诱导该细胞系产生G2/M期阻滞。2.2-ME对cyclin B1, c-Myc等肿瘤相关基因转录表达的影响该部分采用Trizol法提取2-ME处理前后EC9706细胞总RNA, RT-PCR法检测细胞中Bcl-2, Bax, cyclin B1, Tp53和c-Myc五种细胞凋亡相关基因mRNA表达情况。结果显示10μmol/L 2-ME作用24h可使cyclin B1基因mRNA表达水平上调,而进一步延长作用时间对cyclin B1 mRNA表达无明显影响；随着药物作用时问的延长,c-Myc mRNA表达水平逐渐上调。实验结果表明,2-ME可影响细胞凋亡相关基因cyclin B1和c-Myc的转录表达。2-ME可能通过上调cyclinB1 mRNA的表达,参与细胞周期G2/M期阻滞及抑制细胞增殖；c-MycmRNA表达上调可能参与了2-ME诱导EC9706细胞系凋亡的过程。3.2-ME对c-Myc、cyclinBl蛋白表达的影响实验采用Western Blot分析了2-ME作用后两蛋白表达情况,以检测c-Myc和cyclin B1转录表达改变是否可最终导致其蛋白表达水平的改变。1-10μmol/L的2-ME作用24h可上调cyclin B1蛋白表达,采用1μmol/L 2-ME分别处理EC9706细胞24,48和72h均可上调c-Myc蛋白表达。结果表明,2-ME可能通过上调cyclin B1蛋白表达参与EC9706细胞G2/M周期阻滞及诱导细胞凋亡的产生,同时2-ME诱导细胞c-Myc蛋白表达上调可能与EC9706细胞凋亡的发生有密切关系。