文昌鱼作为无脊椎动物到脊椎动物进化过程中的一个重要过渡类群,不仅在形态结构上,而且在基因组水平上都很大程度上保留了脊索动物原始祖先的状态,胚胎发育与脊椎动物相似,是研究发育与进化生物学的理想的实验室模式生物。目前文昌鱼的模式化工作已经取得了一系列重要进展,但在基因功能研究手段方面相对缺乏,其他模式生物中广泛应用的基因功能研究方法一时间还无法在文昌鱼中使用。为此,本文通过克隆文昌鱼热诱导启动子,研发可用于文昌鱼基因功能研究的分子表达调控系统。　　 热休克蛋白70(Heat shock protein70,Hsp70)基因家族是一组进化过程中高度保守的基因家族,作为主要的分子伴侣成员,参与应激条件下机体的保护,促进细胞增殖,抗细胞凋亡,参与机体免疫等方_血的生理反应。该基因家族中诱导型成员容易被外界应激因子诱导而大量表达,因而这些成员的启动子可广泛用于基因表达调控研究以及基因靶向治疗。　　 本文搜索了人、小鼠、爪蟾、斑马鱼、佛罗里达文昌鱼和玻璃海鞘6个物种的基因组数据库,共47个同源基因构建脊索动物Hsp70基因家族系统发生树,可以清晰的显示该基因家族分为两个亚家族,即DnaK和STCH。根据各成员编码蛋白质的定位,DnaK亚家族又可细分为胞质型、线粒体型、内质网型的Hsp70。通过检索佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae)基因组数据库(1attp://genome.jgi-psf.org/),未发现脊椎动物STCH亚家族同源基因,但在Dank亚家族的各组中均发现脊椎动物的同源基因,而且找到了一个与脊椎动物热诱导型Hsp70同源的基因,这个基因结构上也显示较高的保守性。通过一对保守引物,我们从白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)基因组文库中筛选到1个含有文昌鱼Hsp70基因(AmphiHsp70)的BAC(Bacterial artificialchromosome)克隆69-21B,并对该BAC克隆进行了测序分析。结果显示该克隆的插入片段为110,518 bp,包含一个AmphiHsp70完整的编码序列,另外还有7个已确定的编码基因。然而,在佛罗里达文昌鱼基因组数据库中搜寻这8个基因发现,它们分布于4个不同的Scaffold中,进一步分析可排除基因组序列拼接错误的可能,说明这8个基因在2种文昌鱼排布中不是完全的同线性关系,一定程度上反映了2种文昌鱼分歧后产生了较大的遗传分化。　　 我们进一步用31℃、34℃和37℃热激分别处理实验室养殖的白氏文昌鱼0.5h后,立即提取各处理组样品的总RNA并反转录成cDNA,采用Real-timePCR检测AmphiHsp70表达水平变化。结果显示经过热激处理后,受试动物的AmphiHsp70表达量相比正常生长条件(20±2℃)下的表达水平呈现不同程度的上调,其中34℃处理的样品AmphiHsp70表达量约为未热处理样品的1670倍,不过37℃处理的文昌鱼中的AmphiHsp70表达量虽上调了约250倍,但比34℃热处理的样品却低了许多。尽管如此,实验结果表明AmphiHsp70属热诱导型基因,提示其上游启动子可以通过热诱导启动下游基因的表达。　　 BAC克隆69-21B测序使我们获得了白氏文昌鱼AmphiHsp70上游约1.2 kb的非编码序列,经BDGP(http://www.fmitfly.org/seq_tools/promoter.html)及TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)预测,该片段包含了一个核心启动子区域,四个热休克元件(Heat shock element,HSE)、CAAT-box、SP1 bindingsite等主要转录元件。根据转录元件所在的区域,分别克隆了AmphiHsp70翻译起始位点上游七个不同长度的片段P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7,其中P1、P2、P3、P4位于翻译起始位点上游,P5、P6和P7位于转录起始位点上游。将这七个片段分别载入含GFP报告基因表达载体pAcGFP1-1,转染鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma Papulosum Cyprini,EPC),结果显示转染重组质粒P5、P6和P7的EPC细胞都无GFP表达,而转染重组质粒P1、P2、P3、和P4的EPC细胞都有强烈绿色荧光信号表达,说明了发挥AmphiHsp70启动子功能的区域位于翻译其始位点与转录起始位点之间。此外我们将重组质粒P1注入斑马鱼胚胎中,结果显示P1在斑马鱼胚胎中同样能介导GFP的表达,并且受热诱导。综合以上结果可认为这样启动子能为我们以后开展文昌鱼基因功能研究提供一个有力的工具。