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目的意义：供者异源反应性NK细胞在异基因造血干细胞移植中可以发挥移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效应,并减少移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的发生；在实体瘤(如肾细胞癌、黑色素瘤)也有裂解肿瘤细胞的抗实体瘤作用。故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植及抗肿瘤辅助治疗的新策略。但外周血中NK细胞含量少,目前尚缺乏有效的体外扩增体系。本研究目的在于探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法,尤其是自体DCs作为饲养细胞的可行性及效果,并对扩增后NK细胞功能进行评价,以期筛选出有效的NK细胞体外扩增方法,为进一步的临床应用奠定基础。材料和方法：先采用miniMACS免疫磁珠分选方法,从外周血单个核细胞(PBMNC)得到纯化的CD14+单核细胞及NK细胞,随后体外经GM-CSF及IL4诱导单核细胞5天,成为非成熟DCs。在干细胞培养基条件下,NK细胞经IL2和IL15培养5天后,培养体系中加入不同比例的DCs,根据与DC混合的比例及方式将培养体系分为5组：A组：NK／DC=10:1,B组：NK／DC=5:1;C组：NK／DC=2:1,D组：NK／DC=1:1 transwel1非接触共培养,E组(对照组)：不加DC。培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后(CD3~-CD56’)NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞功能的变化(从以下三方面进行)：在不同效靶比下对K562细胞的杀伤作用；realt ime-PCR方法定量检测IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平；流式检测NK细胞表面KIR3DL1. NKG2D表达的变化,并探寻可能的miRNA调控机制。结果：(1)经miniMACS阴性免疫磁珠分选后(CD3~-CD56~+)NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除C组NK细胞纯度略有下降外,其余四组与扩增前无显著性差异(P>0.05)；(2)在各培养体系中A、B、C、D组细胞的扩增倍数分别为168±64.4、170.5±82.6,244.8±148,和70.8±17.5,均显著高于对照组(未加DC)的50.46±4.3(P<0.01)；(3)培养后NK细胞对K562细胞的杀伤活性呈A组≈B组(P>0.05)>C组>D组>E组(P<0.05)。(4)各扩增体系NK细胞IFN-γ、Perforin及GranzymeB基因的表达量均较扩增前(NKO组)明显增加(P<0.01)。(5)细胞因子扩增后CD158e+的细胞下降约10%(P<0.05)。荧光素酶报告实验显示miR-146b可与KIR3DL13’UTR在靶位点特异结合,很有可能调控KIR3DL1的基因表达。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后,在含IL2(200U／mL)+IL15(20ng／mL)的SCGM(含5%人AB血清的)培养条件下,以人外周血单核细胞诱导的未成熟DC作为饲养细胞,当NK细胞与DC比例为10：1时,我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增值倍数高的NK细胞。荧光素酶报告实验显示miR-146b很可能参与调控KIR3DL1的表达.