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肿瘤严重危害人类健康,其发生发展机制非常复杂且未完全阐明,大量研究表明:多种信号途径或转录因子的异常活化起重要作用。核转录因κB(nuclear factor B,NFκB)作为一类能和多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质,在炎症及多种肿瘤中是高度活化的。NFκB的异常活化不仅能够激活多种癌基因的表达,同时还可以下调抑癌基因的表达,致使癌基因和抑癌基因之间的平衡被打破,从而促进了肿瘤的发生发展。因此研究负调控NFκB活化的机制或相关分子对揭示恶性肿瘤的发病机理及寻找肿瘤治疗的新靶分子具有重要的意义。 肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor associated factors3,TRAF3)是NFκB信号转导通路中一个重要的负性调控分子。它是IL-1/TLR家族相关的成员,可以和淋巴毒素β受体(lymphotoxin beta receptor,LTβR)、潜伏膜蛋白基因(latent membrane protein1,LMP1)等结合参与NFκB活化调节。为进一步研究TRAF3及其相关分子调控NFκB的机制,实验室以TRAF3质粒作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选与TRAF3相互作用的相关蛋白,发现尤文家族肿瘤相关蛋白(Ewing sarcoma breakpoint region1, EWSR1)可能与TRAF3相互作用。EWSR1是一种功能尚不明确的蛋白,它可以和11号染色体的FLI1(Friend leukemia virus integration1)易位形成融合蛋白EWS-FLI1,该融合蛋白在95％的尤文氏肿瘤上都有表达,是导致尤文肉瘤发生发展的关键。随后本实验室用免疫共沉淀技术验证出EWSR1和TRAF3确实存在相互作用;确定了EWSR1的相互作用区域在1-265AA和1-349AA,而在TRAF3中只有TRAF端介导了相互作用;并利用体内泛素化实验验证出大剂量的EWSR1可以促进TRAF3的泛素化。这些实验结果让我们对EWSR1及它的融合蛋白如何参与到NFκB信号转导机制中更加感兴趣。 因此为了更深入的探讨TRAF3和EWSR1及它的融合蛋白EWS-FLI1相互作用是如何参与到NFκB活化机制中并对肿瘤发展产生影响的,本研究中,用GST-pull down实验进一步确认EWSR1和TRAF3在体外存在相互作用。通过荧光素酶报告基因系统证实:在NFκB经典通路上,EWSR1能够抑制TRAF3或TRAF6介导的转录活性参与NFκB的活性调控,且它对NFκB信号通路的影响可能不完全依赖和TRAF3的共同作用,而与其自身的RNA结构区域相关;在NFκB非经典通路中,EWSR1却能促进TRAF3或TRAF6介导的转录活性,其中针对TRAF3的作用更关键,EWSR1对非经典通路活性的调节主要依靠和TRAF3的结合。泛素化实验结果表明EWSR1能够促进TRAF3、TRAF6的泛素化。用小干扰RNA敲减EWSR1及EWS-FLI1的表达后,发现TRAF3介导的NFκB信号通路活性发生改变,提示EWSR1和EWS-FLI1可能是NFκB通路调节过程中不可或缺的分子。进一步研究发现EWSR1能够抑制细胞因子TNFα、LPS对NFκB活性的激活,且对TNFα刺激的 NFκB转录活性的抑制作用具有剂量依赖性。荧光共定位实验证实EWSR1及TRAF3共定位于细胞质。免疫组化结果发现EWSR1在正常肝组织、癌旁组织、肝癌组织中都广泛表达,目前没有发现明显的表达差异;而TRAF3主要定位在胞质,在肝癌组织的表达量明显低于正常组织,提示它可能是个抑癌基因。 以上结果提示: EWSR1及EWS-FLI1是TRAF3介导的NFκB通路中关键的分子,参与NFκB信号转导途径的调控,可能在肿瘤发生发展中具有重要的意义。