论文部分内容阅读
目的:通过建立百草枯中毒模型，探讨Salubrina(SAL)调节内质网应激(ERS)途径中PERK-eIF2α信号通路减弱百草枯诱导的人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡的作用机制。 研究方法:建立PQ诱导A549细胞凋亡的模型:对照组（等量PBS）、PQ250μM组、PQ500μM组、PQ750μM组、PQ1000μM组。诱导24h后利用MTT法测定细胞的增殖情况;应用光学倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化;采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡比例;采用分光光度法测定Caspase-3活化程度。提取细胞总蛋白，采用Western Blotting实验方法检测ERS通路相关蛋白GRP78，PERK，p-PERK，ATF6，c-ATF6，IRE1α和p-IRE1α，CHOP的表达变化。选择凋亡率最高的PQ浓度500μM为干预因素，探讨SAL对PQ诱导A549凋亡过程中ERS反应中PERK-elF2α信号通路的影响:SAL预处理A549细胞2h后再加入500μM的PQ，实验分组:对照组（等量0.1％DMSO）、SAL30μM组、PQ500μM组、SAL1μM+PQ500μM组、SAL5μM+PQ500μM组、SAL30μM+PQ500μM组，检测相应的细胞增殖情况、凋亡率、Caspase-3活性变化以及PERK、p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白的表达量。 结果:PQ诱导A549细胞24h后，MTT检测相应的细胞增殖情况，结果提示:随PQ浓度增高，A549细胞增殖明显被抑制;光学倒置显微镜下可见对照组细胞大小形态规则，PQ组细胞随着PQ浓度加大，细胞形态越发不规则，贴壁性降低，细胞连接减少;透射电镜下观察到PQ诱导后A549细胞体积缩小，核质浓缩，染色质逐渐聚集成新月状附于核膜周边，细胞膜周边出现凋亡小体，粘液空泡数目较多;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，发现A549细胞凋亡率在PQ浓度为500μM时达到最高;分光光度法测定Caspase-3活性，PQ浓度为500μM时，Caspase-3活性较对照组显著增加;在PQ（500μM）诱导A549细胞3h、6h、12h、24h时，GRP78，CHOP蛋白表达量随时间延长，蛋白表达显著增加，p-PERK，c-ATF6和p-IRE1α的表达在6h时显著增加。SAL以剂量依赖性方式改善了经PQ处理后A549细胞增殖被抑制、降低凋亡率和Caspase-3活性。在SAL30μM+PQ500μM组，SAL可以诱导出高水平的p-eIF2α，同时CHOP表达减少，而PERK和p-PERK的表达与PQ500μM组相比未见明显差异。 结论:PQ可以通过激活ERS途径，引发人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡;SAL对PQ诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549发生凋亡具有保护作用，其机制与调节ERS反应中未折叠蛋白反应(UPR)的PERK-eIF2α通路相关。