牛多杀性巴氏杆菌是一种能引起牛出血性败血症和牛肺炎的重要病原，给肉牛养殖带来了巨大的经济损失。根据其荚膜抗原不同可分为A、B、D、E、F等5种血清型，其中血清B和E型主要导致牛出血性败血症，血清A和F型主要引起牛呼吸系统疾病，导致牛肺炎。近年来，随着肉牛养殖的迅速发展，肉牛的频繁调运导致的运输应激致使牛多杀性巴氏杆菌病的流行呈上升趋势。目前，我们对牛多杀性巴氏杆菌致病机制还知之甚少，同时针对这方面的研究也较少，本文拟通过研究牛多杀性巴氏杆菌诱导细胞炎性的信号通路，探讨牛多杀性巴氏杆菌的致病机制，为牛多杀性巴氏杆菌病新的控制策略及新型疫苗研发提供思路。　　本实验以牛多杀性巴氏杆菌A型（PmA）和B型（PmB）菌株分别感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过qRT-PCR、Western Blot、ELISA等技术手段研究其炎症机制，其主要目标为：　　（1）在体外条件下，探究PmA和PmB是否可以诱导巨噬细胞的炎性反应；　　（2）Toll样受体是否参与炎症信号通路的激活；　　（3）NF-κB、MAPK信号通路是否参与了炎症信号通路的调节；　　（4）炎性小体是否参与炎症信号通路的调节；　　（5）细胞吞噬作用是否影响炎症信号通路的调节。　　具体结果如下：　　1．PmA、PmB诱导巨噬细胞的炎症反应　　采用不同的感染复数（MOI）PmA、PmB感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，在0.5 h、1 h、2 h、3h收集处理后的细胞和上清，qRT-PCR检测IL-1β。Western Blot检测IL-1β、IL-18蛋白的表达情况，ELISA检测炎症细胞因子IL-1β、IL-18、TNF-α的分泌情况。结果显示，PmA、PmB感染巨噬细胞后IL-1β mRNA表达上调，呈剂量依赖型；Western Blot检测IL-1β、IL-18蛋白表达显著增高；ELISA检测IL-1β、IL-18、TNF-α分泌显著的增高；说明PmA、PmB感染巨噬细胞后炎症信号通路的激活。　　2．TLR2、TLR4介导炎症信号通路　　为了研究Toll样受体是否参与炎症信号通路的激活，采用10 MOI PmA、PmB感染巨噬细胞，qRT-PCR检测TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9的mRNA表达情况。结果显示TLR2、TLR4 mRNA表达水平显著增高，而TLR1、3、5、6、7、8、9并没显著增高，说明TLR2、TLR4参与炎症信号通路的调节。　　3．NF-κB、MAPK信号通路参与炎症信号通路的调节　　为了研究P38、JNK、NF-κB信号通路在PmA、PmB感染小鼠巨噬细胞的调节作用，本实验采用10μmol的P38、JNK、NF-κB信号通路抑制剂 SB203580、SP600125、PDTC处理巨噬细胞1 h，再进行10 MOI PmA、PmB感染，荧光定量qRT-PCR检测IL-1βmRNA表达水平。结果显示，加入P38、NF-κB信号通路抑制剂PmA感染后IL-1β显著降低，加入JNK、P38、NF-κB信号通路抑制剂PmB感染后IL-1β显著降低，表明P38、NF-κB参与了PmA诱导的炎症信号通路，JNK、P38、NF-κB参与了PmB诱导的炎症信号通路。　　4．炎性小体参与炎症信号通路的激活　　为了研究炎性小体在炎症信号通路中的作用，10 MOI PmA、PmB感染巨噬细胞后，在不同的时间点荧光定量qRT-PCR检测NLRP1、AIM2、NLRP3、NLRC4、NLRP6和炎性小体接头蛋白ASC mRNA表达水平，同时收集细胞进行Western Blot检测NLRP3蛋白表达情况。采用0.8μmol Caspase-1的抑制剂VX-765抑制细胞后，qRT-PCR检测IL-1β mRNA的表达情况。结果显示，NLRP1、AIM2、NLRC4并没有显著的增高，NLRP3、NLRP6的表达水平显著增高，但是开始上调的时间不一样，表明NLRP3、NLRP6参与了PmA、PmB诱导的炎症信号通路的调节，Western Blot检测NLRP3蛋白表达与qRT-PCR结果一致。ASC mRNA表达水平显著增加和IL-1βmRNA表达趋势相一致，且呈剂量依赖型，炎症复合体接头蛋白ASC的激活说明炎性小体参与了PmA、PmB诱导的炎症信号通路；VX-765抑制后IL-1βmRNA被显著的抑制，说明IL-1β的表达依赖于Caspase-1，验证了炎性小体的激活，同时也说明IL-1β在PmA、PmB诱导的炎症反应的重要作用，可作为检测炎症反应是否激活的指标。　　5．NF-κB、MAPK信号通路参与炎性小体的调控　　为了研究P38、JNK、NF-κB信号通路和炎性小体的关系，采用10μmol的P38、JNK、NF-κB信号通路抑制剂SB203580、SP600125、PDTC处理巨噬细胞1 h，再进行10 MOI PmA、PmB感染，荧光定量qRT-PCR检测NLRP3、NLRP6的表达情况，结果表明，加入P38、NF-κB信号通路抑制剂PmA感染NLRP3显著降低，但是NLRP6显著增加。加入JNK、P38、NF-κB信号通路抑制剂PmB感染后NLRP3显著降低，NLRP6显著增加，推测P38、NF-κB信号通路对NLRP3是正调控，对NLRP6是负调控，而JNK对于NLRP3调控不显著但是对于NLRP6是负调控。　　6．细胞吞噬作用参与炎症信号通路的激活　　为了研究细胞吞噬作用和PmA、PmB诱导的炎症信号通路的关系，实验采用细胞松弛素D处理1h后，使细胞失去吞噬作用，10 MOI PmA、PmB感染巨噬细胞，qRT-PCR检测IL-1β、ASC、NLRP3、NLRP6 mRNA表达水平，结果显示，IL-1β、ASC、NLRP3都有极显著性的降低，但是NLRP6出现显著上调。表明细胞吞噬作用参与了PmA、PmB诱导的炎症反应。　　7.结论　　（1）PmA、PmB感染小鼠巨噬细胞后激活了炎症信号通路，TLR2、TLR4介导炎症信号通路。　　（2）P38、NF-κB信号通路参与PmA诱导的炎症信号通路；JNK、P38、NF-κB信号通路参与PmB诱导的炎症信号通路。　　（3）NLRP3、NLRP6炎性小体参与PmA、PmB诱导的炎症信号通路。　　（4）推测在PmA、PmB诱导的炎症信号通路中P38、NF-κB信号通路对NLRP3正向调控，JNK、P38、NF-κB信号通路对NLRP6负向调控。　　（5）细胞吞噬作用参与PmA、PmB诱导的炎症信号通路的激活。