乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝性，非细胞病变的DNA病毒，感染后很容易导致慢性化。在HBV慢性感染的病人中，由于特异性的抗病毒T细胞免疫缺乏或损坏，常常导致病毒持续性感染并发展为严重的肝脏疾病。虽然有关T细胞对HBV抗原低反应或耐受的机制目前还不完全清楚，大量的研究提示有调节功能的CD4⁺和CD8⁺T细胞可能在抑制HBV特异性的T细胞应答中发挥重要作用。CD3⁺CD8^lowT细胞是细胞表面CD8分子下调的一群CD8⁺T细胞，在很多慢性持续性抗原刺激的情况下增多，如HIV感染病人，器官移植病人以及慢性寄生虫感染的小鼠。研究发现这群细胞属于2型极化T细胞，具有较低的细胞毒性，在某些情况下可通过其分泌的IL-10或细胞表面表达的膜型TGF-β1发挥抑制作用。在本研究中，考虑到慢性HBV感染也是一种持续性的抗原刺激，我们的目的是探索CD8^lowT细胞在慢性HBV感染病人受损的CD8⁺T细胞应答中是否发挥作用以及何种作用。一．慢性HBV感染病人外周血中CD8^lowT细胞的频率高于健康人本研究中我们选择了47个慢性HBV感染病人和19个健康人对照，分离这些个体的外周血单个核细胞并通过流式细胞术检测其中CD8^lowT细胞的频率。我们发现慢性HBV感染病人外周血中CD8^lowT细胞的频率高于健康人对照，同时发现感染HBV时间长于5年的病人较低于5年的病人含有更高的CD8^lowT细胞。二．病人外周血中CD8^lowT细胞的频率与血浆中HLAI类分子的浓度正相关我们通过ELISA检测了病人和健康人血浆HLAI类分子的浓度，发现病人血浆HLAI类分子的浓度显著高于健康人。同时发现，病人外周血中CD8^lowT细胞的频率与血浆中HLAI类分子的浓度成正相关，而健康人中并未发现相关。三．病人外周血中CD8^lowT细胞的表型通过流式细胞术检测CD8^lowT细胞一些与效应和抑制有关的标记的表达，发现相比健康人，病人中的CD8^lowT细胞在表型上更接近2型极化T细胞（较多的IL-4表达和较少的IFN-γ表达），并显示出调节或抑制性的特征（抑制性标志上调，特别是膜型TGF-β1）。四．病人中CD8^lowT细胞的频率与HBc18-27特异性CD8⁺T细胞应答负相关通过IFN-γELISPOT检测病人和健康人HBc18-27特异性CD8⁺T细胞应答。发现相比正常人，病人的HBc18-27特异性CD8⁺T细胞应答显著降低，并且与CD8^lowT细胞的频率成负相关，提示病人中的CD8^lowT细胞可能具有抑制功能。五．结论慢性HBV感染病人外周血中CD8^lowT细胞群显著增多，其在表型上趋向2型极化T细胞，且一些抑制性标志表达升高，这可能是导致慢性HBV感染病人CD8⁺T细胞应答低下的其中一个原因。T细胞通过其细胞膜上的T细胞受体（TCR）与抗原提呈细胞上的肽-主要组织相容复合物（pMHC）结合发挥其细胞免疫及免疫调节功能。通过对TCR的研究既可明确T细胞抗原识别的分子机制，又可发展基于TCR的免疫治疗手段。近期的研究提示TCR基因转导后的T细胞具备相应的特异性免疫调节或细胞毒特性，在治疗恶性肿瘤，自身免疫病，慢性病毒感染疾病等方面有巨大发展潜能。获得目的表位特异性单克隆TCR是研究TCR免疫治疗的关键。TCR通过数目繁多的编码基因不同的排列组合使其多样性达到1018之多，从如此庞大的T细胞库中钓取任意表位特异性的TCR犹如大海捞针。现有单克隆TCR的获得主要是通过特异性T细胞体外扩增及单克隆化技术，然而却存在T细胞难以长期在体外单克隆化增殖以及培养周期长等问题。本研究以HLA-A2限制性黑色素瘤相关抗原表位gp100为例，通过体外单一表位同种特异性T细胞扩增体系及pMHC四聚体分选技术获得高亲和力表位特异性T细胞，并建立TCR单细胞扩增技术，结合快速表达和鉴定体系，为利用基于TCR的免疫干预提供有效可行的方法。一．设计扩增TTCCRRα与β链的引物群并验证各条引物的有效性根据IMGT/Gene-DB （http://imgt.cines.fr/）提供的所有有编码功能的TCR α与β链可变区（V）和不变区（C）基因片段序列，经过基因扫描、比对，利用primerpremier5软件共设计出59条上游引物和4条下游引物，分别可与TCR α与β链的V基因和C基因配对。应用所设计的引物群对健康人外周血T细胞进行PCR扩增，发现几乎每对TCR α链引物均可扩增获得与TCR的α链编码基因长度一致的片段，而且每对TCRβ链引物均可扩增获得与TCR的β链编码基因长度一致的片段，说明我们设计的TCR α与β链的引物群可用于扩增TCR的编码序列。二．TCR单细胞RT-PCR的建立1.从单个Jurkat细胞中扩增TTCCRRα及β链选择表达TCR的人T细胞瘤细胞系Jurkat细胞，对其进行单克隆化，摸索单细胞RT-PCR的条件。将Jurkat细胞有限稀释成理论上的单细胞并裂解细胞得到单个细胞的RNA，用特异性引物即α及β链C区外侧引物（共两条）逆转录得到单个Jurkat细胞的cDNA，利用35对α链混合引物与24对β链混合引物扩增出单个Jurkat细胞的TCRα及β链基因，并将PCR扩增获得的基因克隆入T-easy载体中，对克隆基因测序并在NCBI中比对测序结果。结果显示，扩增序列与NCBI中显示一致，α及β链使用的V区分别为TRAV8-6与TRBV12-3。2.从健康人外周血单个CD8+T细胞中扩增TTCCRRα及β链分离健康人外周血单个核细胞（PBMC），并用CD8磁珠阴性分选出CD8+T细胞。将CD8+T细胞有限稀释成理论上的单细胞，调整单个Jurkat细胞TCR扩增方法，对单个CD8+T细胞进行RT-PCR扩增TCRα及β链基因，在12个单细胞中可成功的从其中的5个单细胞中获得TCR的α链基因，从其中8个单细胞中成功获得TCR的β链基因。将扩增获得的TCRα及β链基因经过测序获得编码序列。三．体外混合淋巴细胞培养扩增单一表位（pMHC）特异性T细胞将荷载抗原肽gp100后的T2细胞（TAP缺陷,仅表达HLA-A2，T2/gp100）作为刺激细胞，与HLA-A2阴性个体（HLA-A2-ve）的PBLs长期共培养14天后，诱导产生出T2/gp100表位特异性的细胞毒性T细胞（CTL-T2/gp100）。利用制备的gp100/HLA-A2四聚体和无关HBc/HLA-A2四聚体对诱导产生的CTL-T2/gp100染色发现gp100/HLA-A2四聚体对CTL-T2/gp100染色阳性率显著高于无关HBc/HLA-A2四聚体的同型对照染色，说明诱导出的CTL是T2/gp100表位特异性的。四．利用TCR单细胞扩增技术对分选获得的gp100/HLA-A2特异性T细胞进行TCR扩增通过流式细胞仪分选出gp100/HLA-A2四聚体染色阳性的CTL-T2/gp100，将分选得到的细胞单细胞化，用建立的TCR单细胞RT-PCR方法扩增表位特异性TCR的α及β链基因，经测序比对确定从10个单细胞中得到5个α链及5个β链基因（其中4对配对）。五．gp100/HLA-A2特异性TCR的表达及鉴定选择扩增成功的gp100/HLA-A2特异性TCR的其中一对α及β链基因,将其序列进行密码子优化后转入昆虫杆状病毒pfast-dual双表达载体中，表达可溶性gp100/HLA-A2特异性TCR。用western-blot检测蛋白具有正确的构象和分子量，用ELISA检测蛋白的特异性结果不太理想，分析可能是我们选取的TCR亲和力不足以检测到或是可溶性TCR分子的浓度较低所致。六．结论我们建立了一种从人T细胞库中扩增表位特异性单克隆TCR的方法，该方法不受表位的限制，为进一步利用基于TCR的免疫干预提供了基础。