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第一部分氧化应激抑制KGF对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用[目的]建立早产新生大鼠高氧暴露肺损伤细胞模型,探讨常氧及高氧环境下,角化上皮生长因子KGF对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生存凋亡的影响。[方法]建立原代培养的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤模型,随机分为KGF干预组和对照组,采用流式细胞仪检测细胞内活性氧ROS水平,采用MTT、LDH法检测细胞存活、死亡情况,Western Blot检测活化caspase-3蛋白的表达。[结果](1)常氧环境下加入KGF,0-25ng/ml范围内,与空白对照组相比,各组MTT依次升高、LDH依次下降,呈剂量依赖性；>50ng/ml时,MTT、LDH变化无显著差异。(2)高氧环境下培养细胞,随通氧时间的延长,与空气对照组相比,细胞内ROS水平显著升高、MTT明显降低、LDH显著升高；高氧4h、8h时,活化的Caspase-3表达依次升高。(3)高氧环境下培养细胞0.5h～12h,分别给予15-100ng/ml KGF。0.5h、1h时,KGF各浓度组MTT值高于对照组,LDH低于空气对照组,<50ng/ml范围内呈现剂量依赖性；高氧4h,KGF>50ng/ml时LDH低于对照组,15-25ng/ml范围内MTT高于对照组；8h时,需提高KGF浓度到50ng/ml、75ng/ml,对应的MTT值、LDH值与对照组相比具有统计学意义；12h时,KGF各浓度组与对照组相比均无统计学意义。高氧4h、8h时,分别给予25、75ng/ml KGF,激活的Caspase-3表达明显低于对照组。[结论]KGF能够在常氧、短时间高氧情况下促进肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖、抑制凋亡,但延长的高氧暴露会降低KGF敏感性,抑制KGF保护效应第二部分氧化应激诱导胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞发生KGF抵抗的机制探究[目的]通过早产新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤的模型,探讨高氧环境下,长时间高浓度氧暴露诱导ATIICs发生KGF抵抗的分子机制。[方法]无菌、氧浓度95%的高氧环境中培养原代SD大鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机将细胞分为单纯高氧暴露组和角化上皮因子(Keratinocyte growth factor, KGF)处理组。高氧暴露0-36h,MTT法检测细胞存活增殖情况；LDH法检测细胞死亡情况；实时荧光定量PCR测定KGFR mRNA的表达; Western Blot测定KGFR蛋白、磷酸化p53、HDAC1、乙酰化H3、乙酰化H4的表达；免疫共沉淀技术检测磷酸化p53与HDAC1之间的联系；抗氧化酶系的活性由相应的商品化试剂盒测定。[结果]与单纯高氧组细胞相比：1)高氧暴露4h,KFGR mRNA的表达开始降低,8h、12h时,KFGR mRNA的表达明显低于对照组；相应的,高氧暴露24-36h,KFGR蛋白的表达明显降低；2)高氧暴露4h、8h、12h后,p53392位丝氨酸位点的磷酸化(Phospho-p53(ser392))水平显著升高,总p53表达量不变；3)免疫共沉淀实验证明磷酸化p53(ser392)的活化进一步招募下游分子HDAC1的表达增加,p53抑制齐pifithrin-a可以抑制磷酸化p53(ser392)的活化,同时抑制p53对HDAC1的招募。4)乙酰化组蛋白H4在高氧暴露4h、8h后表达水平明显降低,而乙酰化组蛋白H3的表达未见明显变化；HDAC抑制剂TSA可以抑制高氧诱导的乙酰化组蛋白H4的表达下调5)高氧环境下,KGF对抗氧化酶系的表达无显著影响[结论]高氧环境,KGFR表达水平下调是诱导ATIICs引起KGF抵抗的主要原因,其中Phospho-p53(ser392)-HDAC1-乙酰化组蛋白H4信号通路的活化是导致KGFR表达水平下调的关键第三部分α-硫辛酸协同KGF对对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤的保护机制[目的]通过早产新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤的模型,探讨高氧环境下,α-硫辛酸协同KGF联合应用对肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤的的保护作用及机制[方法]无菌、氧浓度95%的高氧环境中培养原代SD大鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机将细胞分为单纯高氧暴露组、KGF处理组、α-硫辛酸(α-Lipoic acid, α-LA)处理组及KGF-αt-硫辛酸共处理组。高氧暴露下,采用流式细胞仪检测细胞内活性氧族(reactive oxygen species, ROS)水平,MTT法检测细胞存活增殖情况；LDH法检测细胞死亡情况；实时荧光定量PCR测定KGFR mRNA的表达；Western Blot测定KGFR蛋白、磷酸化p53的表达。抗氧化酶系(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、总抗氧化能力)的活性由相应的商品化试剂盒测定。[结果]1)与单纯高氧组相比,随着高氧暴露时间的延长,α-硫辛酸组细胞内活性氧ROS水平显著降低；2)与单纯高氧组相比,高氧暴露4h、8h,α-硫辛酸组磷酸化p53(ser392)的表达明显降低；高氧暴露24h、48h时,KGFR的表达明显高于前两组；3)与单纯高氧组、KGF处理组相比,高氧暴露8h、12h, KGF-α-硫辛酸共处理组ATⅡCs MTT水平明显高于前两组；LDH释放水平显著低于前两组,细胞保护作用显著；4)与单纯高氧组相比,aα-硫辛酸组可以显著提高细胞内谷胱甘肽还原酶的活性,提高总抗氧化能力；[结论]高氧暴露环境下,α-硫辛酸能明显降低细胞内氧化应激水平,抑制磷酸化p53(ser392)的活化、抑制高氧诱导的KGFR表达下调,从根本上解决KGFR抵抗现象。因此,KGF与α-硫辛酸联合应用可以最大程度的发挥KGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞高氧损伤的的保护作用。