目的： 1.第一部分 观察由HIV-1的反式激活蛋白转导域(TAT-proteintransductiondomain，TAT-PTD)携带的人酸性成纤维细胞生长因子(humanacidicFibroblastGrowthFactor，aFGF)和6×组氨酸的融合蛋白TAT-aFGF-His通过角膜滴入给药进入视网膜组织的情况。并构建融合蛋白aFGF-His作为对照蛋白。 2.第二部分 眼角膜滴用融合蛋白TAT-aFGF-His对大鼠实验性视网膜缺血再灌注(retinalischemia-reperfusion，RIR)损伤的治疗作用，并探讨其作用机理。 方法： 1.第一部分 PCR扩增aFGF-His基因片段，利用BglⅡ和BamHⅠ的同尾酶特性，用NdeⅠ和BglⅡ双酶切扩增产物并与NdeⅠ和BamHⅠ双酶切处理的质粒pET-3c相连，转化至大肠杆菌DH5α，氨卞青霉素筛选阳性克隆。抽提经测序鉴定序列正确的重组质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，利用氨卞抗性筛选出转化子。分别用IPTG诱导表达融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His，cM离子交换及肝素亲和两步层析法分离纯化蛋白。 健康SD大鼠36只随机分为生理盐水组(NS组)、aFGF-His组和TAT-aFGF-His组，每组12只，NS组滴入生理盐水，aFGF-His组滴入2μgaFGF-His，TAT-aFGF-His组滴入2μgTAT-aFGF-His。大鼠给药后分别于10min、30min、1h、2h、4h和8h处死，每时间点2只，双眼给药。用6×His抗体，采用免疫组化SABC法检测aFGF-His和TAT-aFGF-His在角膜和视网膜组织的分布情况。 2.第二部分 健康SD大鼠45只随机分为生理盐水治疗组(简称A组)、aFGF-His治疗组(简称B组)、TAT-aFGF-His治疗组(简称C组)。各组大鼠均采用前房灌注加压形成14.6kPa高眼压，维持60min建立RIR模型。再灌注开始后及每隔1d，A组滴入生理盐水，B组滴入2μgaFGF-His，C组滴入2μgTAT-aFGF-His进行治疗。各组大鼠分别于再灌注1，3，7d处死，每时间点5只，每组右眼为实验眼，左眼为正常对照眼。动物造模前及处死前行视网膜点图(ERG)检测，记录ERGa波和b波波幅。光学显微镜下观察视网膜组织病理学变化(HE染色)，记录视网膜内层(IRL)厚度和视网膜神经节细胞(RGCs)数目的变化。采用原位凋亡检测法(TUNEL)检测视网膜神经节细胞层(GCL)和内核层(INL)的细胞凋亡情况。 结果： 1.第一部分 正确构建表达质粒载体pET-aFGF-His。经IPTG诱导后，融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His的表达量分别占菌体总蛋白的30％和27％，均为可溶性表达。经两步层析纯化后，获得了纯度大于95％的TAT-aFGF-His和aFGF-His蛋白。免疫组化结果表明，NS组、aFGF-His组在角膜和视网膜组织均未见到His染色阳性细胞。TAT-aFGF-His组在10min、30min、1h、2h、4h、8h的角膜和视网膜组织均能见到阳性细胞，主要分布在角膜上皮细胞层和视网膜节细胞层。10min时有微量TAM-aFGF-His进入视网膜组织，30min时TAT-aFGF-His在视网膜的分布达到高峰，8h时TAT-aFGF-His大部分被清除。 2.第二部分 ①ERG检查：与A组相比，B组ERGa波和b波波幅在1，3，7d均无明显差异(P＞0.05)。与A和B组比较，再灌注3d，C组ERGa波波幅(149.6±26.33μv)明显高于A组(25.6±7.40μv)和B组(49.8±5.89μv)(P＜0.01和P＜0.05)；再灌注3，7d，C组ERGb波波幅(194.8±38.92μv和334.0±67.52μv)明显高于A组(62.0±15.41μv和145.2±22.51μv)和B组(60.8±8.07μv和152.8±22.16μv)(P＜0.05)。 ②视网膜组织病理学变化：RIR损伤早期，IRL水肿增厚，GCL和INL均可见核固缩细胞，晚期RGCs数目减少，IRL萎缩变薄。与A组相比，B组在再灌注1d，IRL厚度有差异(P＜0.05)，而其余各时间点，RGCs数目和IRL厚度均无差异(P＞0.05)。与A和B组比较，再灌注1d，C组IRL水肿更严重(P＜0.05)，而RGCs数目均多于前两组，但只与A组有统计学差异(P＜0.05)；再灌注3d，C组与前两组相比，IRL厚度均无差异(P＞0.05)，而RGCs数目明显多于前两组(P＜0.01)；再灌注7d，C组IRL厚度大于前两组(P＜0.05)，且RGCs数目均多于前两组(P＜0.01)。 ③视网膜组织细胞凋亡：正常大鼠视网膜TUNEL染色阴性，A、B、C组视网膜GCL和INL均可见大量棕黄色阳性细胞，并随再灌注时间的增加而减少。与A组相比，B组在再灌注各时间点的阳性细胞数均无显著差异(P＞0.05)。与A和B组比较，再灌注1d，C组INI，的阳性细胞与A组有差异(P＜0.05)，但与B组无显著差异(P＞0.05)；再灌注3d，C组GCL和INL的阳性细胞数明显少于前两组(P＜0.01)；再灌注7d，C组GCL的阳性细胞明显少于前两组(P＜0.05)。 结论： 1.角膜滴用2μgaFGF-His蛋白不能进入视网膜组织，TAT蛋白转导域能有效携带aFGF-His(TAT-aFGF-His)穿透眼球血眼屏障进入眼底到达视网膜组织。 2.成功构建视网膜缺血再灌注模型。 3.TAT-aF6F-His蛋白能够改善RIR损伤的组织病理学变化，抑制细胞凋亡，对视网膜细胞功能恢复有作用。 4.TAT-aF6F-His对RIR损伤的治疗可能通过抑制细胞凋亡和保护神经节细胞的途径。 5.为角膜滴用TAT-aFGF-His蛋白治疗视网膜缺血再灌注损伤提供理论依据。