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纳米技术是以纳米尺度的产物为对象,几年来迅猛发展的一项新技术。目前日益增长的研究热点立足于纳米科技在工程和医药领域内的巨大潜力,纳米粒子广泛应用于药物载体、细胞分离纯化、组织修复、磁共振造影剂、肿瘤热疗等方面。于此同时,纳米粒子的毒性及毒作用机制也日益引起人们的关注。
量子点是一种粒径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒,在激发光照射下会发射荧光。相对传统有机荧光试剂,量子点在荧光强度、光稳定性等方面具有无可比拟的优越性。将量子点与生物大分子偶联可代替传统的荧光染料分子,作为荧光探针广泛应用于生物分子、细胞以及活体标记。
为了进一步加深对Fe2O3纳米粒子毒性和毒作用机制的认识,本课题是以磁性Fe2O3纳米粒子对体外培养人肝癌细胞株HepG2染毒,进行细胞增殖及形态学检测,并通过DNA凝胶电泳、线粒体膜电位检测、Annexin-V/PI法检测细胞凋亡率、细胞内活性氧水平、WesternBlot法检测p53和caspase-3蛋白表达的方法探讨Fe2O3纳米粒子对于细胞增殖的影响以及其诱导凋亡的可能机制。同时,本课题以链霉亲和素-生物素结合的CdSe/ZnS量子点为荧光探针,对HepG2细胞磷脂酰丝氨酸以及Bcl-2和Bax蛋白的表达进行了检测,并与传统FITC探针进行了比较。从而评价了量子点作为荧光探针在毒理学检测中的应用价值,并进一步探讨Fe2O3纳米粒子诱导HepG2细胞凋亡的途径。试验结果表明:
1、在本试验条件下,Fe2O3纳米粒子对体外培养HepG2细胞有生长抑制作用,并能够引起HepG2细胞培养介质中LDH水平显著升高,膜通透性增加。Hoechst荧光染色后,染毒细胞的细胞核呈现凋亡形态。提示Fe2O3纳米粒子可影响HepG2细胞增殖。
2、在本试验条件下,Fe2O3纳米粒子可使HepG2细胞DNA发生有规律的断裂,细胞凋亡率显著增加,细胞线粒体膜电位的下降,细胞内活性氧增加,p53和caspase-3蛋白的表达量增加,提示Fe2O3纳米粒子诱导HepG2细胞发生凋亡。
3、在本试验条件下,Fe2O3纳米粒子可使细胞膜表面出现明显PS蛋白外翻现象,细胞内Bcl-2表达下调,而细胞内Bax表达上调,Bcl-2/Bax比率逐步下降。提示Fe2O3纳米粒子诱导细胞凋亡与Bcl-2/Bax途径有关。
4、用量子点荧光标记的荧光图像较传统荧光染料具有荧光强度强,检测灵敏度高等优点,且具有较强的抗光漂白性能综上所述,我们可以初步认为:Fe2O3纳米粒子可抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,诱导细胞发生亚细胞水平的形态学变化,引起细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、细胞内活性氧增加,导致细胞DNA断裂、凋亡率增加,Fe2O3纳米粒子诱导HepG2细胞凋亡的机制与p53和Caspase-3蛋白表达上调有关,可能通过Bcl-2/Bax途径最终导致细胞死亡。量子点荧光标记在毒理学检测中具有较大的发展潜力。