急性B细胞系白血病(B系ALL)是儿童血液系统最常见的恶性肿瘤，也是儿童时期死亡率很高的疾病。目前的主要治疗方法是抗肿瘤药物的联合化学治疗(化疗)，必要时加放射治疗(放疗)。尽管化疗和放疗的治疗作用勿庸置疑，但尚存在严重的缺陷，即它们在杀伤恶性细胞的同时对正常细胞也可造成不同程度的伤害。免疫毒素通常是采用具有一定导向作用的先导分子和药物耦合而成，它们对人体肿瘤具有明显的导向治疗作用，可克服当前化疗和放疗普遍存在的缺陷。因此，开展免疫毒素的肿瘤导向治疗研究具有极其重要的意义。 有效的导向治疗取决于良好的先导分子及其携带的毒素，以与白细胞表面分化抗原特异性结合的单抗作为载体，将药物特异地带到白血病细胞膜上或细胞内，以达到杀灭白血病细胞的目的，有着无可替代的优势。有些免疫毒素的动物和临床研究已取得理想的疗效。因此，开展免疫毒素的肿瘤导向治疗研究具有极其重要的意义。 目前国际上抗人CD19单抗有B4、B43、HD37、ZCH-4-2E8、SJ25C1和FMC63等几十种，其中有3株(B4、B43和HD37)被研制成免疫毒素：B43-4’，5’，7-三羟基异黄酮(B43-Gen)、B43-商陆抗病毒蛋白(B43-PAP)、HD37-去糖基蓖麻毒素A链(HD37-dgRTA)和B4-封闭性蓖麻毒素(Anti-B4-bR)；这些免疫毒素导向杀伤B系ALL的动物和临床研究已取得了较为理想的效果。国内对该靶分子的导向杀伤研究未见报道，采用抗人CD19新克隆ZCH-4-2E8作为先导分子进行导向杀伤研究国内外均未见报道。 2E8是本实验室研制的经国际鉴定为特异性识别CD19抗原的单抗，并正式纳浙江大学硕士学位论文 中文摘要入了国际CD命名系统。 许多毒素被用于研制兔疫毒素，如：蓖麻毒蛋白 A链kicin A chain入 商陆抗病毒蛋白（poke忧ed antiviral protein，PAP），绿脓杆菌外毒素（exotoxin ofpseudomonas aeruglnosa，ETA），4’，5’尸－二羟基异黄酮（genistein，Gen）等。Gen是蛋白酪氨酸激酶抑制剂，与抗体偶合后能有效的杀伤白血病细胞。Uckun等报道B43－Gen在体外能杀死 99．999％有 CD表达的 Nalm－6细胞，对化疗失败的 B系ALL患者仍有效。 本实验通过双功能光敏偶合剂Sulfo－SANPAH在体外进行2E8与Gen的铰联来完成2E8．Gen免疫毒素的研制，并研究其对CD19＋白血病细胞的导向杀伤作用，初步探讨其杀伤机制，为进一步研究第二代兔疫毒素如单链抗体免疫毒素pCFVimmunotoxinX人鼠嵌合性抗体和人源化抗体奠定基础。 材料与方法1．ZCH－4．2E8腹水的制备、纯化和鉴定 2E8细胞经3次亚克隆化后按常规方法制备大量腹水，采用改良B。VV幻法纯化IgM型2E8单抗。纯化后2E8样品用二硫苏糖醇0TT）还原，经十二烷基硫酸钠一聚丙稀酚胺（SDS－PAGE）凝胶电泳鉴定其纯度。二．2E8－Gen免疫毒素的研制 2E8与Gen偶合是通过双功能铰联剂Sulfo－SANPAH在体外进行化学铰联（按SUlfO七ANPAH试剂说明书并参考文献X再经纯化而获得。并用色谱层析法检查游离Gen的去除情况。3．细胞培养及实验分组 2E8、Nalm七旧细胞白血病）、K562（红白血病）和讪卜3 门细胞白血病）细胞株在含 20％灭活小牛血清的 RPMI 640培养液中，常规条件下培养。取处于对数增长期、存活率达 95％以上的细胞用于实验。 实验分组如下：（）对照（NC）组：同期培养不加药；（2）2E8－Gen兔疫毒素O）组：加不同浓度的2田乃m（）磷酸盐缓冲液o＊S，既是2田乃n第 2浙江大学硕士学位论文 中文摘要3次的透析外液也是其溶剂）组：加入与2m乃 相同体积的PSS：N）＊m组：加不同浓度的Gen（500nM、40W和 100W）；（5）纯2E8组：加入与2E8．Gen中载体单抗2E8相同浓度和相同体积的未与Gen结合的纯2E8。培养时间和起始细胞数量按实验需要而定。测绘细胞生长曲线时细胞培养于24孔板，MTT法细胞培养于96孔板。4．细胞观察 用倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态及形态学特点，照相记录。5．生长曲线测定 用苔盼蓝拒染法测绘各组的Nalm－6、K562和Molt3细胞培养3～5天的生长曲线。每组均以相隔24小时为一观察点，每观察点做3个复孔。6．MTT比色法测定 将细胞接种于96孔板中，加药后再加培养基到每孔200PL培养，实验终点后，力入浓度为 sing 加L的 MTT溶液每孔 20pL，继续培养 4 ’J’时，经 2000rPmX20min离心，吸去培养基，加入二甲基亚矾m）2每孔200pL以溶解沉淀物，振荡smin后用酶标仪检测。每24 ／J’时为一观察点，每观察点做3或12个复孔。7．双色流式细胞仪检测 荧光素标记的连接素 V／碘化丙旋unnexin V干ITC小）染色和操作步骤按试剂盒说明书进行，l小时内用流式细胞仪检测分析。8．统计学处理 全部数据采用“S6．12统计软件处理。数据以均值士标准差（肚m）表示，采用学生t检验，尸