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背景与目的内毒素诱导ALI (endotoxin-induced acute lung injury)是当前呼吸危重病研究热点之一。内毒素可直接和间接导致肺血管内皮细胞的损伤与凋亡。近年来,活化蛋白C因具备抗凝、抗炎、抗凋亡、保护内皮屏障等多种生物学功能而用于严重脓毒血症治疗,并显著改善该类患者预后。研究证实,活化蛋白C抗凋亡作用与其参与线粒体凋亡途径以及死亡受体凋亡途径有关,但是内质网(endoplasmic reticulum, ER)是否也参与活化蛋白C的抗凋亡机制尚未见报道。本研究旨在探讨APC干预内皮细胞凋亡模型后,是否能够诱导ER应激及其与APC抗凋亡作用的关系,以及是否能够通过诱导ER应激而产生GSK-3β介导的抗凋亡效应,从而提出APC抗凋亡效应的新机制,为APC在内毒素诱导ALI干预治疗中的应用提供更多实验室依据。方法1.利用流式细胞仪及Caspase-3活性检测,观察不同剂量与时间的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激对HUVECs (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)凋亡的影响,构建LPS诱导的HUVECs凋亡模型；2.利用Western blot技术检测150nM APC干预HUVECs后糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)表达情况,利用流式细胞仪凋亡检测技术观察APC对LPS诱导HUVECs凋亡的影响；3.利用流式细胞仪检测技术及Caspase-3活性检测,观察ER钙离子释放阻滞剂TMB-8 (8-[N, N-diethyla-mino]-octyl-3,4,5-trimethoxy-benzoate, TMB-8),对150nM APC抑制脂多糖(Lipopoly saccharide, LPS)诱导HUVECs凋亡的影响；4.利用Western blot检测技术,观察APC干预LPS诱导HUVECs凋亡后GSK-3β与p53蛋白的变化情况；5.利用RT-PCR与Western blot技术,对预先设计合成好的GSK-3p-siRNA进行验证；利用流式细胞仪检测技术观察沉默GSK-3β基因表达对APC抑制LPS诱导HUVECs凋亡作用的影响。结果(1)以0.1、1、10、20μg/ml LPS刺激HUVECs,可见0.1μg/ml LPS镜下观变化不易察觉,1、10、20μg/ml LPS均可导致显著的细胞形态变化,但10、20μg/mlLPS处理]HUVECs24小时后死亡明显增多；(2)采用150nM APC对LPS预处理24小时的HUVECs进行干预,6小时可见GRP78表达明显升高,并持续至24小时,各时间点GRP78表达与对照组比较均有统计学意义(P<0.05),与单纯APC刺激HUVECsGRP78表达比较也具有统计学意义(P<0.05); (3) LPS预处理HUVECs24小时后,同时给予150nM APC及50umol/L的TMB-8,6、12、24小时流式细胞仪检测结果中凋亡细胞比例以及Caspase-3活性检测与对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。(4)1μg/ml LPS处理HUVECs24小时后GSK-3β表达略有增加,p53表达显著增加,在给予150nM APC干预后可见GSK-3β表达显著增加(P>0.05),p53表达明显下降。(5)在GSK-3p-siRNA转染细胞中,Caspase-3活性及流式细胞仪检测结果均显示与GSK-3p正常表达细胞比较存在统计学意义(P<0.05)；而对GSK-3p-siRNA转染细胞给予APC干预后的Caspase-3活性检测结果与无APC干预的对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论本研究明确了APC可作为一种内质网应激原：(1)刺激内皮细胞产生的UPR,可能在APC抑制LPS诱导HUVECs凋亡中发挥细胞保护作用；(2)刺激HUVECs后诱导的短暂内质网源性钙离子释放,对LPS诱导IUVECs凋亡并未产生影响;(3)诱导产生内质网应激,并通过GSK-3β介导实现抑制LPS诱导的内皮细胞凋亡效应。