烟草SCAR标记技术的建立及其应用研究

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本课题以烤后烟叶为材料,通过RAPD标记向SCAR标记转化,建立烟草SCAR标记技术的转化方法,并应用烟草SCAR技术构建烟草SCAR指纹图谱库,得到以下主要结论:(1)烤后烟叶基因组DNA提取方法的优化:对改良CTAB法中主要影响因素单因素优化结果表明:CTAB沉淀缓冲液使用DNA溶液体积的1.5倍、裂解时间40min、Tris平衡酚的抽提1次和RNase A(10mg/mL,1μL)37℃处理10min时提取得到的烤后烟叶基因组DNA,主带清晰单一,纯度OD260/OD280处于1.7~1.9之间,浓度可达到382.500ng/μL,达到后续PCR实验对DNA模板的要求。(2)RAPD引物筛选:通过RAPD分析,每条引物都能扩增出4~14条条带,L112可扩增出14条带,其中8条为多态性条带。部分扩增结果稳定可用烟草品种鉴定并转化为SCAR标记的引物有OPZ-4等15条。(3)烟草品种RAPD遗传关系分析:通过遗传关系分析,12个烟草品种的遗传系数在0.1875~0.8421之间,平均值为0.5721。其中红花大金元与NC102之间的遗传距离最小,为0.1875,云烟87和龙江911之间遗传距离最大,为0.8421,聚类分析表明:12个烟草品种分为三大类,第一大类中包括两个亚类Ⅰa和Ⅰb共8个品种,第二大类中包括3个品种,KRK26单独聚为第三大类。(4)烟草RAPD标记向SCAR标记转化:通过对RAPD标记L34313bp的特异片段回收纯化,克隆测序,分析其序列信息并设计SCAR引物对S-1/S-2,经过退火温度的优化成功将RAPD标记L34313bp转化为SCAR标记,并建立了烟草SCAR标记技术的转化方法。(5)烟草SCAR标记技术的应用:利用6对SCAR引物的扩增图谱,建立12个烟草品种的SCAR图谱库、分子ID和鉴别路线。建立的12个烟草品种的SCAR图谱库,可鉴别12个品种中的某一个品种和将12个烟草品种一一鉴别,且不受烟草品种的亲缘关系和疾病抗感性影响。
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