背景:军事预防医学的任务是,以部队群体为主要的研究与保障对象,运用宏观与微观相结合的方法,研究武器装备、军事环境、军事作业和其它有关因素,比如,作业环境、作业方式、生活方式、生物遗传等,对军队人员健康的影响和所致伤害及其防护、预防与控制伤病的发生与流行,促进成员身心健康、提高战斗力。肝脏是人体最大的解毒器官,对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物,具有生物转化作用,通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外。但肝脏很容易受特殊条件下生活方式、心理因素以及生物化学战剂如布鲁氏杆菌、肉毒杆菌毒素等的影响,患上如甲型或乙型肝炎、中毒性肝炎、或是肝硬化等疾病,在人口密度较高的军队集中爆发,危害肝脏健康,产生致命的伤害,影响作战能力。我国是肝病大国,患病人口多,基数大,且病程长,病死率高,将会在很大程度上影响我国国民身体素质,对我国国防力量建设产生影响。肝衰竭仍然是一个急剧性的、不可预知的疾病,具有从60%到90%不等的高死亡率。许多研究表明,肝衰竭是由于大量的肝细胞坏死导致广泛的有毒物质在血液积累使得肝脏功能急性衰退。肝性脑病,是一种严重的神经精神并发症的急性和慢性肝衰竭,与氨浓度剧烈升高有密切关系。现在肝衰竭的治疗主要是基于减少氨产生、增加氨在肠道吸收的原则,多通过利福昔明和乳果糖起作用的。原位肝移植是肝衰竭有效的治疗方法,但是现在能够用于移植的肝脏数量有限,而人工肝可为患者提供部分营养需求并帮助患者清除体内的有害物质,是肝脏移植的有效替代治疗方法。新鲜分离出的人原代肝脏细胞是用于药物研发、临床研究以及生物人工肝的最理想的细胞来源,但是由于肝脏供体的严重稀缺及很难在体外维持细胞功能等特点,使之不能扩大应用范围;而其他细胞构成的分析模型,如动物来源的原代肝脏细胞,或人肝癌细胞系,其功能皆不能和正常人肝细胞相比拟,因为它们与人原代肝细胞往往呈指数级差异;干细胞是具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞,且由于它的低免疫原性,临床使用过程中并没有明显的副作用和不良反应,因此医学界将其称为“万用细胞”,而被认为是生物人工肝理想的种子细胞,基于近年来各国诸多科学家的研究,使干细胞肝向诱导分化所得的肝细胞最接近正常人原代肝细胞,但是目前遇到的瓶颈问题是,这类在体外定向分化获得的肝细胞,可能不会表现出完善的功能,出现不能很好地表达成熟肝细胞所特异表达的转录因子或蛋白质的现象,而又或者是功能成熟的细胞数量很少,很难大规模应用。肝脏是人体的一个巨大的“化工厂”,承担着人体内糖、蛋白质、脂类等多种物质代谢,合成胆汁、白蛋白,进行解毒、免疫、产生凝血因子、维持电解质平衡等诸多功能。因此,维持人工肝内所使用肝细胞的功能对于晚期肝病患者的治疗至关重要。我们以解氨毒为例,期望能够获得足够的具有高效解氨毒能力的细胞,并且能够在体外操作,通过直观观察即能评价其功能的体系。由于终末期肝病患者往往伴随着高血氨症致的肝性脑病,而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS1),是尿素循环的限速酶,它存在于肝细胞的线粒体中,促进将有毒的游离氨转换成无毒产物尿素,而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ的这种转化能力作为成熟肝细胞功能的指标,不仅提示我们诱导CPS1表达的小分子化合物可能具有提高肝细胞的其他功能的作用,还有可能,那些能使CPS1功能降低或缺失的小分子化合物,会使细胞形态及性状发生改变,逆转细胞命运。由于终末分化的体细胞可以通过强制表达一些特异的转录因子而被重编程为多能干细胞,表明细胞的命运是可逆转的,且不同谱系特异的转录因子的组合还可以直接将人和鼠的体细胞转分化为心肌细胞,肝细胞或神经细胞,为疾病模型的构建及再生医学提供了可供选择的途径。与基因重组因子相比,化学方法使用的小分子化合物具有细胞渗透性,易于合成、保护以及规范化,同时这种方法还具有可塑性。此外,研究者还可通过控制小分子化合物的浓度和持续时间来微调整个过程。化学方法通过诱导调节多个信号通路,调节细胞转录因子和特殊基因的表达,从而促进细胞形态及功能发生转变,绕开了其他细胞重编程方法带来的技术问题和安全问题,给那些被传统治疗方法认为是“不治之症”的疾病治疗带去希望。目的:目前主要的挑战是如何获得足够可用于生物人工肝进行体外解毒的细胞,尤其是针对清除体内游离氨而提高生物人工肝在临床使用的效果,并且能在体外操作,通过直观观察即能评价体外分化的肝脏细胞成熟情况的有效筛选体系;并以此为基础,优化已发现的有效药物对肝细胞作用的条件,进一步提高药物作用效率并减少对肝细胞的损伤。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建靶向CPS1的sg RNA及打靶载体,分别用试剂转染和电转人肝癌细胞系Hep G2、正常人肝细胞永生化细胞系LO2以及人胚胎干细胞;用PCR扩增技术检验筛选得到细胞的DNA片段;用流式对基因编辑过的细胞进行分群;用免疫荧光进行靶蛋白定位、筛选及鉴定;通过实时定量PCR分析不同荧光强度细胞克隆的肝功能相关基因的表达情况;利用相应的试剂盒对不同荧光强度细胞克隆的白蛋白分泌量、CYP3A4酶活性、氨清除能力以及尿素生成能力进行检测分析;利用高内涵细胞成像技术对不同药物及不同药物浓度对细胞荧光强度的影响进行统计分析;利用CCK8试剂盒检测不同药物及不同药物浓度对细胞的毒性;Western Blotting分析白藜芦醇及si CPS1处理后细胞中氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ蛋白水平的变化;观察LO2细胞克隆形态以评价药物对细胞的影响,初步探讨其可能诱导重编程的机制。结果:基因测序显示打靶载体构建正确;用打靶载体中的增强型红色荧光蛋白(td Tomato)标记CPS1基因后的Hep G2、LO2细胞以及人胚胎干细胞经过G418筛选,自发表达红色荧光蛋白;琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增细胞DNA片段,目的条带大小正确;通过流式分选获得不同荧光强度的细胞,且经过免疫荧光染色对靶蛋白定位后,获得在线粒体中表达CPS1蛋白的细胞克隆,5个Hep G2-CPS1-2atd Tomato细胞克隆,4个LO2-CPS1-2atd Tomato细胞克隆。实验结果显示不同荧光强度的Hep G2细胞克隆和LO2细胞克隆,其CPS1、AAT、ALB、CYP450家族、TF基因表达水平不同,且其白蛋白分泌量,CYP3A4酶活性,氨清除能力以及尿素生成能力不同,并且呈正相关性。因此,我们可在此基础上通过直观观察荧光强度的增强或减弱而筛选小分子化合物,其中苯丁酸钠和白藜芦醇能够显著提高细胞荧光强度、CPS1基因表达水平、氨清除能力和尿素生成能力,除此之外,还有效地提高了AAT、ALB、TF、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、C/EBPα、HNF4α、FOXO3a等功能基因和转录因子的表达水平;白藜芦醇和si CPS1在分别增强和抑制了CPS1的基因、蛋白表达水平的基础上,也分别增强和抑制了细胞的红色荧光强度;当红色荧光蛋白标记了CPS1的胚胎干细胞肝向诱导至成熟阶段,线粒体红色荧光蛋白开始表达;减弱了LO2细胞中红色荧光蛋白强度的小分子化合物,还能在长期无血清的细胞培养过程中诱导细胞形态及性状改变,干性基因表达水平升高。结论:基于CRISPR/Cas技术的基因打靶,建立CPS1-2atd Tomato肝细胞系Hep G2和LO2、胚胎干细胞报告细胞体系,结合细胞影像能够筛选调控细胞命运的小分子化合物,与人胚胎干细胞向肝细胞定向分化体系或是诱导分化成熟的体细胞重编程恢复多功能干性的体系结合,可以成为在体外获得稳定代谢功能的人肝细胞的可靠筛选模型,为以后提供供体细胞、建立人源化动物模型在体研究和应用分化的干细胞进行体外药物筛选都具有着十分重要的意义,而且用这样的评价体系得到的肝脏细胞若具有和人成体肝脏细胞相类似的m RNA转录水平和蛋白表达水平,那么我们便可以用这个体系筛选出来的细胞做为药物开发中检测肝脏毒性、药物相互作用评估的工具。更为重要的是,若筛到的小分子化合物可促进细胞重编程,那我们便用化学法开启了细胞重编程的安全模式。