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半乳糖凝集素是一种糖粘合蛋白家族，其对β-半乳糖苷有高度亲和性。迄今为止已经发现15种半乳糖凝集素，他们都含有一个高度保守的糖识别域(carbohydrate cognition domain，CRD)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是galectin家族中唯一的嵌合型代表，由一个CRD和串联重复结构域组成。Galectin-3蛋白在细胞内和细胞外都有表达，调节肿瘤细胞的凋亡、粘附、增殖血管形成。Galectin-3广泛表达于正常组织和肿瘤组织中，其表达水平与肿瘤的恶性程度有密切关系。正常生理情况下，galectin-3分泌到细胞外的水平较低。文献报道在乳腺癌病人血液中表达水平升高，更有趣的是乳腺癌转移患者血液中的表达水平成倍增加。基于该临床现象，本论文拟揭示转移的乳腺癌病人血液中的高水平galectin-3的来源及其与乳腺癌转移间的关系。 一、体外实验 实验方法: (1)采用乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的培养基上清液与HUVEC共孵育，获得条件培养基。将条件培养基与单核细胞THP-1共孵育。通过Westernblotting方法检测THP-1细胞的培养基上清中galectin-3水平的变化。 (2)采用炎症因子蛋白质芯片法、ELISA方法、Western blotting方法检测MDA-MB-231细胞、HUVEC细胞、THP-1细胞间相互作用的细胞因子。 实验结果: (1)乳腺癌细胞的培养基上清刺激HUVEC后的分泌物可诱导单核细胞分泌 galectin-3，三种细胞缺一不可。 将条件培养基与单核巨噬细胞THP-1共孵育后，发现THP-1细胞培养上清中galectin-3的含量明显升高，并呈一定的浓度依赖性，而两种乳腺癌细胞的培养基上清直接刺激单核细胞THP-1不能增加galectin-3的分泌，表明乳腺癌细胞的培养基上清刺激HUVEC后的分泌物可诱导单核细胞分泌galectin-3，三种细胞缺一不可。 (2) MDA-MB-231细胞上清液可以刺激HUVEC细胞分泌大量的GM-CSF，进一步激活单核细胞THP-1分泌galectin-3。 炎症因子蛋白质芯片检测结果发现HUVEC细胞经MDA-MB-231细胞上清液刺激后的上清液中GM-CSF高表达。ELISA方法定量检测GM-CSF水平进一步确证这一结果。 (3) MDA-MB-231细胞高表达VEGFA，作用于HUVEC细胞表面的VEGF受体，导致GM-CSF大量分泌，进一步激活THP-1细胞产生galectin-3。 ELISA方法检测结果发现SH-SY5Y细胞上清液几乎不能刺激HUVEC分泌GM-CSF。Western blotting方法检测MDA-MB-231细胞与SH-SY5Y细胞培养上清液中VEGFA的表达水平，结果发现MDA-MB-231细胞分泌的VEGFA水平明显高于SH-SY5Y细胞。接下来采用VEGF受体抑制剂索拉菲尼进行反证，结果发现索拉菲尼可显著抑制MDA-MB-231细胞的培养基上清刺激HUVEC分泌GM-CSF的水平。表明MDA-MB-231细胞高表达VEGFA，作用于HUVEC细胞表面的VEGF受体，导致GM-CSF大量分泌，进一步激活THP-1细胞产生galectin-3。 二、体内实验 实验方法: 利用免疫缺陷裸小鼠尾静脉注射生物发光标记乳腺癌DA-MB-231-luc细胞，来建立乳腺癌肺转移模型。采用氯膦酸二钠脂质体以清除小鼠体内的单核巨噬细胞，检测小鼠血清中galectin-3的水平，以揭示单核细胞与乳腺癌转移中循环galectin-3升高的关系。另外，在体内实验中设立索拉菲尼给药组，以期观察索拉菲尼对裸鼠乳腺癌肺转移的作用及与血清galectin-3表达之间是否有相关性。同时，还设立了索拉菲尼与氯膦酸二钠脂质体合用组，试图观察两者合用后对小鼠肺转移的作用以及对galectin-3水平调节的作用。 实验结果: (1)氯膦酸二钠脂质体与索拉菲尼二者合用有明显的增效减毒作用。 结果发现氯膦酸二钠脂质体可抑制乳腺癌肺转移;氯膦酸二钠脂质体与索拉菲尼合用后进一步增强了抑制乳腺癌肺转移的作用。通过测定裸小鼠体重，发现氯膦酸二钠脂质体单用组小鼠体重有下降趋势，但与索拉菲尼合用后体重下降趋势明显减弱。提示二者合用有明显的增效减毒作用。 (2)索拉菲尼可明显抑制乳腺癌肺转移，但是对血清中galectin-3的表达水平无明显影响。 结果显示索拉菲尼对乳腺癌肺转移的抑制率达到56.78％，但是对血清中galectin-3的表达水平无明显影响。 (3)单核-巨噬细胞是乳腺癌转移过程中循环galectin-3分泌的主要来源细胞。 通过氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内单核巨噬细胞后，小鼠血清galectin-3浓度明显降低。提示在乳腺癌转移过程中单核巨噬细胞是循环galectin-3的主要来源细胞。 实验结论: 1.体外实验中，乳腺癌细胞通过分泌VEGFA与血管内皮细胞HUVEC作用，刺激血管内皮细胞HUVEC分泌GM-CSF，进而刺激单核细胞分泌galectin-3。 2.体内实验发现单核-巨噬细胞是乳腺癌转移过程中循环galectin-3分泌的主要来源细胞。 3.氯膦酸二钠脂质体与索拉菲尼二者合用有明显的增效减毒作用。