目的和意义叉头框(Forkhead box, FOX) K1属于FOX转录因子家族,与多种肿瘤相关。本课题组此前的研究亦显示FOXK1能够促进结直肠癌的发生发展。然而,FOXK1与胃癌的关系仍不明确。我们通过生物信息学软件分析FOXK1转录起始上游的启动子,发现上面有包括c-jun在内的多种转录因子的结合位点。c-jun是JNK通路的经典下游分子,为已被确定的癌基因。很多研究表明c-jun能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭,包括胃癌。本课题旨在研究FOXK1在胃癌发生发展中的作用,并明确c-jun能否在转录上调控FOXK1进而影响FOXK1对胃癌的作用,为阐明FOXK1在胃癌发生发展中的作用和机制,以及FOXK1在胃癌诊断和治疗中的潜在价值奠定理论基础。材料和方法主要材料人胃癌细胞系AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、MKN28,抗人FOXK1、c-jun、E-cadherin、vimentin等抗体,双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CHIP试剂盒、免疫组化试剂盒、western blot相关试剂、cck-8试剂盒、EdU试剂盒和transwell小室等。主要方法1. FOXK1促进胃癌细胞增殖及侵袭转移1.1 FOXK1在人胃癌组织中的表达情况收集10例新鲜胃癌及癌旁组织,利用western blot检测FOXK1在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况；收集20例胃癌及其癌旁组织制成石蜡标本,利用免疫组化染色验证western blot结果。1.2过表达FOXK1促进胃癌细胞的增殖能力转染pcDNA3.1-FOXK1和对照pcDNA3.1质粒到MKN28细胞,利用含有1000μg/ml G418的完全培养基筛选培养,建立单克隆稳定表达株MKN28-FOXK1。western blot验证MKN28-FOXK1中FOXK1的表达情况。利用cck-8和EdU两种方法比较MKN28-FOXK1和对照细胞株MKN28-Vector的增殖能力。1.3过表达FOXK1促进胃癌细胞的侵袭与转移MKN28-FOXK1和MKN28-Vector接种至6孔板,融合度接近100%时,用移液器枪头划痕,光镜下记录划痕区相对距离,继续常规培养,每隔12h拍照记录一次,评估胃癌细胞的转移能力：将Matrigel铺至transwell小室底部制成侵袭小室,室内为用无血清培养基培养的MKN28-FOXK1或MKN28-Vector,室外为完全培养基,常规培养24小时后用0.2%结晶紫染色,显微镜下计数侵袭至小室背面的细胞数量,评价高表达FOXK1对细胞侵袭能力的影响。2. FOXK1参与胃癌细胞的EMT2.1 FOXK1促进胃癌细胞的EMT光镜下观察MKN28-FOXK1和MKN28-Vector细胞的形态差异；细胞免疫荧光和western blot检测MKN28-FOXK1和MKN28-Vector细胞中的E-cadherin和Vimentin的表达情况。2.2 FOXK1参与TGF-β1诱导的胃癌细胞EMTwestern blot检测不同浓度(0、0.5、1.0、2.0ng/ml) TGF-β1处理MKN28后细胞中FOXK1、E-cadherin和vimentin的表达。用1μg/ml TGF-β1处理MKN28并在Oh、24h和48h分别收集细胞蛋白,western blot检测不同时间点FOXK1、 E-cadherin和vimentin的表达。转染FOXK1-siRNA和对照siRNA至MKN28细胞,24小时后加或不加TGF-β1,48小时后用western blot检测FOXK1、 E-cadherin和vimentin的表达；或用transwell侵袭小室检测处理后细胞的侵袭能力。3. FOXK1为转录因子c-jun的转录激活靶点3.1 c-jun能与FOXK1的启动子区域结合并启动下游转录根据FOXK1启动子(600bp)内c-jun的三个潜在结合位点设计三对引物,扩增出FOXK1转录起始位点上游的三段启动子序列,分别插入到pGL3-Basic载体,构建出三个含不同结合部位的pGL3-FOXK1promoter(记为FOXK1p1, FOXK1p2和FOXK1p3)。将上述FOXK1p和c-jun表达质粒或对照质粒共转染至MKN28中,进行双荧光素酶检测并比较各组荧光素酶活性差异。另外利用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法,再次明确c-jun与FOXK1启动子结合及其大致结合位点。3.2 c-jun能与FOXK1启动子区域结合设计突变引物,以FOXK1p为模板进行扩增得到c-jun结合位点突变的产物,纯化并酶切突变产物,再将其与酶切后的pGL3相连,然后转化入感受态细胞扩增,将突变质粒测序以确定突变成功并将其命名为FOXK1-mut。双荧光素酶检测并比较野生型和突变型的荧光素酶活性以明确c-jun结合的具体位置。再将不同量(0,0.3,0.5,0.8,1.0μg)的c-jun表达质粒和FOXK1p共转染至MKN28中,以明确FOXK1启动子被激活的程度是否随c-jun表达水平的递增而上升。4. FOXK1与c-jun的表达在胃癌中具有相关性且与胃癌患者的预后相关4.1 FOXK1与c-jun的表达在胃癌细胞系中具有相关性提取人胃癌细胞系AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、MKN28的细胞蛋白,用western blotting检测不同胃癌细胞中FOXK1和c-jun的表达水平,并用细胞免疫荧光检测FOXK1和c-jun两中蛋白的细胞内亚分布。4-2FOXK1与c-jun在胃癌组织中高表达且其表达具有相关性收集90例胃癌及其癌旁组织,定制组织芯片,利用免疫组化染色检测FOXK1和c-jun在胃癌及其癌旁组织的表达水平,并由两名病理医生对染色程度进行评分；对评分进行散点分布、线性回归及相关分析以比较FOXK1和c-jun在胃癌及癌旁组织的表达差异,以及明确两种蛋白表达上的相关性。4.3 FOXK1/c-jun表达与胃癌患者临床病理参数的关系运用卡方检验分析FOXK1/c-jun的表达水平与胃癌患者临床病理参数之间的关系。4.4 FOXK1/c-jun表达与胃癌患者预后的关系收集105例胃癌患者的随访资料,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线；应用单因素和多因素COX回归模型分析影响胃癌患者生存的独立预后因素。5.敲减siRNA c-jun能降低FOXK1对胃癌细胞增殖、转移的促进作用并能抑制FOXK1引起的胃癌细胞EMT5.1敲减c-jun能降低FOXK1的促胃癌细胞增殖作用运用RNAi技术敲减MKN28-FOXK1细胞的c-jun表达量,western blot检测敲减效率；cck-8和EdU检测c-jun表达下降后细胞增殖能力的改变。5.2敲减c-jun能降低FOXK1的促胃癌细胞迁移侵袭作用划痕实验及transwell侵袭实验检测c-jun表达下降后细胞迁移及侵袭能力的改变。5.3敲减c-jun能抑制FOXK1引起的胃癌细胞EMT光镜下观察敲减c-jun后MKN28-FOXK 1细胞形态的改变；细胞免疫荧光检测EMT相关分子E-cadherin和Vimentin的变化；Western Blot检测EMT相关分子E-cadherin、-catenin.Snail.MMP2.MMP9.Vimentin和相关通路Erk、AKT的变化。6.c-jun对FOXK1介导的胃癌细胞皮下成瘤及体内转移的影响6.1敲减c-jun对FOXK1介导的胃癌细胞皮下成瘤的影响在5-6周龄大的BALB/c雌性裸鼠皮下分别注射5*106个细胞／只的MKN28-Vector、MKN28-FOXK1、MKN28-FOXK1-c-jun shRNA细胞,35天后处死,比较三组皮下肿瘤的大小：免疫组化检测肿瘤中Ki-67和CD105的表达情况。6.2敲减c-jun对FOXK1介导的胃癌细胞体内转移的影响将5*106/只的MKN28-vector、MKN28-FOXK1和FOXK1+c-jun shRNA三种细胞分别经尾静脉注射到三组裸鼠(n>3)体内,40天后处死裸鼠并观察其肺部形成的肿瘤结节数量及体积：免疫组化检测各组肺部肿瘤FOXK1、c-jun的表达；免疫组化及qpcr检测各组肺部肿瘤E-cadherin的表达。结果1. FOXK1促进胃癌细胞增殖及侵袭转移1.1 FOXK1在人胃癌组织中的表达情况FOXK1在细胞中定位于胞核,且癌旁正常组织呈现无表达或者低表达而胃癌组织高表达。1.2过表达FOXK1促进胃癌细胞的增殖能力FOXK1表达上调后,胃癌细胞的OD450处的吸光值明显增加；EdU显示处于DNA合成期的细胞数量上升。1.3过表达FOXK1促进胃癌细胞的侵袭与转移FOXK1能促进胃癌细胞的划痕愈合能力；过表达FOXK1后穿过transwell小室的细胞数量明显增多。2. FOXK1参与胃癌细胞的EMT2.1 FOXK1促进胃癌细胞的EMT过表达FOXK1后胃癌细胞从上皮细胞形态向间质细胞形态转变；上皮细胞标志E-cadherin表达下调,间质细胞标志Vimentin表达则上升。2.2FOXK1参与TGF-β1诱导的胃癌细胞EMT胃癌细胞内FOXK1的表达对TGF-β1存在剂量依赖性和时间依赖性,TGF-μ1在诱导胃癌细胞EMT的同时导致FOXK1表达增高；FOXK1-siRNA阻断了TGF-β1引起的EMT并抑制了胃癌细胞的侵袭能力。3.FOXK1为转录因子c-jun的转录激活靶点3.1c-jun能与FOXK1的启动子区域结合并启动下游转录生物信息学分析发现：在FOXK1启动子600bp内存在3个潜在的c-jun结合位点；双荧光素酶实验和ChIP证明c-jun能与FOXK1启动子上结合位点结合,位置可能在-362355或-386379。3.2 c-jun能与FOXK1启动子区域-362355结合通过对结合位点进行点突变并比较野生型与突变型的荧光素酶活性,证明c-jun与FOXK1启动子结合的具体位置在-362355；而且随着c-jun表达水平的上升,FOXK1启动子被激活的程度亦增强。4. FOXKl与c-jun的表达在胃癌细胞系及胃癌组织中具有相关性且与胃癌患者的预后相关4.1 FOXK1与c-jun的表达在胃癌细胞系中具有相关性免疫荧光显示FOXK1与c-jun在胃癌细胞MKN28中均主要定位于细胞核；Western blot证实,c-jun在胃癌细胞系AGS.BGC823.MGC803及MKN28中均有较高表达而在SGC7901及MKN45中表达相对较低；除了MGC803,FOXK1的表达水平在其余5种细胞株中与c-jun类似。4.2 FOXK1与c-jun在胃癌组织中高表达且其表达具有相关性对90例胃癌组织及癌旁正常组织的免疫组化评分和相关统计学分析显示FOXK1与c-jun在胃癌组织中的表达水平均较癌旁正常组织高,且两者表达水平具有相关性。4.3 FOXK1/c-jun表达与胃癌患者临床病理参数的关系FOXK1和c-jun表达均与肿瘤分化程度、AJCC分期、肿瘤淋巴结转移和浆膜浸润存在统计学相关性(均为p<0.05),但与患者年龄、性别、肿瘤大小无统计学相关性(p>0.05)。4.4 FOXK1/c-jun表达与胃癌患者预后的关系Kaplan-Meier法显示FOXK1高表达的患者总生存时间(22.897±2.956)较短,FOXK1低表达的患者总生存时间(63.928±3.151)较长,差异具统计学意义(P<0.001);c-jun高表达的患者总生存时间(23.709±3.203)较短,c-jun低表达的患者总生存时间(59.648±3.705)较长,差异具统计学意义(P<0.001)；FOXK1和c-jun均为低表达的患者生存时间最长(64.125±3.852),而FOXK1和c-jun较为高表达的患者生存时间最短(18.479±2.788),差异具统计学意义(P<0.01)。单因素Cox比例风险模型分析显示,预后与分化程度,AJCC分期,淋巴结转移,浆膜浸润,FOXK1表达水平,c-jun表达水平密切相关。多因素Cox比例风险模型分析结果显示AJCC分期与FOXK1表达水平为胃癌预后的独立危险因素。5.敲减c-jun能降低FOXKl对胃癌细胞增殖、转移的促进作用并能抑制FOXKl引起的胃癌细胞EMT5.1敲减c-jun能降低FOXK1的促胃癌细胞增殖作用western blot检测c-jun siRNA能有效降低c-jun表达；RNAi降低c-jun表达后cck-8显示MKN28-FOXK1细胞的OD450处的吸光值明显下降；EdU显示处于DNA合成期的细胞数量下降。5.2敲减c-jun能降低FOXK1的促胃癌细胞迁移侵袭作用c-jun表达下降后MKN28-FOXK1的划痕愈合速度明显减慢；穿过transwell小室的细胞数量明显减少。5.3敲减c-iun能抑制FOXK1引起的胃癌细胞EMT敲减c-jun的表达之后MKN28-FOXK1细胞恢复到上皮细胞的形态；细胞免疫荧光显示转染了c-jun siRNA之后细胞内E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调；Western Blot显示FOXK1过表达后E-cadherin和γ-catenin表达下调,Snail.MMP2.MMP9.Vimentin.p-AKT以及p-ERK表达均上升,而在敲减c-jun的表达之后能逆转这些变化。6.敲减c-jun对FOXKl介导的胃癌细胞皮下成瘤及体内转移的影响6.1敲减c-jun对FOXK1介导的胃癌细胞皮下成瘤的影响FOXK1过表达的MKN28-FOXK1组的肿瘤体积明显大于MKN28-vector组(p<0.0001)；而在敲减c-jun后,与MKN28-FOXK1组相比FOXK1+c-jun shRNA组的肿瘤体积明显缩小(p<0.0001)；免疫组化显示MKN28-FOXK1组的Ki67阳性细胞数多于其他两组,且由CD105显示的血管密度MKN28-FOXK1组亦明显高于其他两组。6.2敲减c-jun对FOXK1介导的胃癌细胞体内转移的影响MKN28-FOXK1肺部肿瘤结节的数量及体积均大于其他两组；免疫组化显示MKN28-FOXK1组肿瘤部位的FOXK1及c-jun的阳性程度均高于另外两组；免疫组化及q-RT-PCR检测均显示MKN28-FOXK1组肿瘤的E-cadherin表达水平最低。结论1. FOXK1在胃癌组织中高表达并能促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移活性；FOXK1参与TGFβ诱导的EMT；2.双荧光素酶.CHIP实验、结合位点突变均证实FOXK1启动子区域-362355处存在c-jun结合位点；c-jun能够与FOXK1的启动子结合并激活下游基因活性：3. FOXK1和c-jun均在胃癌组织细胞中呈现高表达且两者的表达呈正相关；FOXK1和c-jun的表达与胃癌患者预后相关；FOXK1能够作为判断胃癌预后的独立危险因素；4.C-jun作为FOXK1的上游调控分子,降低c-jun表达能抑制FOXK1诱导的EMT和胃癌细胞增殖、侵袭转移能力；5.体内实验再次验证c-jun参与调节FOXK1诱导的胃癌细胞EMT和侵袭转移。以上结果均提示c-jun在一定程度上参与了FOXK1的转录调控并影响FOXK1在胃癌发生发展中的作用；c-jun为癌基因,FOXK1为促进胃癌的侵袭转移的转录因子,c-jun/FOXK1在胃癌EMT及侵袭转移中具有重要作用。