猪场及其周边环境中抗生素耐药基因流行分布特征研究

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抗生素耐药基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)污染目前已成为全球关注的热点问题。抗生素耐药细菌(Antibiotic Resistance Bacteria,ARB)携带的ARGs会随着宿主细菌在环境中扩散和传播,而养殖业被认为是环境中ARGs增加的主要原因。目前我国猪场及其周边环境中ARGs的流行及分布的数据缺乏,因此本研究利用高通量荧光定量PCR技术,调查我国多个省份的部分猪场及其周边环境中ARGs的流行分布,并通过宏基因组方法探讨了厌氧发酵处理对养殖场污水中ARGs和微生物群落的影响,研究为掌握我国猪场的ARGs流行分布情况提供基础数据。本研究采集了福建、海南、江苏、江西和浙江五个省份的猪场中猪粪、土壤以及污水共计189份样品,利用高通量荧光定量PCR技术进行了涵盖介导16类抗生素耐药的共计285个ARGs的相对丰度和多样性检测,结果显示不同省份不同猪场样品中ARGs的流行分布存在差异性,但氨基糖苷类耐药基因、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B类(MLSB)耐药基因和四环素类耐药基因相对丰度检出率较高,约占总ARGs相对丰度总和的59.26%。而猪粪的ARGs相对丰度检出率最高,其次是污水,最后是土壤。进一步通过宏基因组测序对福建省三个猪场样品进行分析,共检出14类抗生素耐药基因,其中四环素类耐药基因、大环内酯类耐药基因和氨基糖苷类耐药基因在所有样品中含量均较高,与高通量荧光定量检测数据相吻合。而磺胺类耐药基因、酰胺醇类耐药基因、甲氧苄氨嘧啶类耐药基因和β-内酰胺类耐药基因仅在土壤和污水中含量较高,在猪粪中检出率较低。此外,三个猪场污水经过厌氧处理后,总耐药基因相对丰度大大降低,出水中各类耐药基因的相对丰度低于进水的相对丰度,表明污水经过厌氧发酵处理对于抗性基因具有一定的去除效果。但是部分基因如erm(42),tet(M),tet(O),cfx A,bla VEB,aph(2’)-Ic,tet(Y)等经厌氧发酵后其相对丰度有所增加;同时比较了处理前后细菌群落结构的变化,发现部分细菌如弯曲菌目(Campylobacterales)螺杆菌科(Helicobacteraceae)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)糖螺菌科(Saccharospirillaceae)和韦荣氏球菌属(Veillonellales)韦荣氏菌科(Veillonellaceae)有所增加,推测这些增加的细菌是上述相对丰度增加的耐药基因的潜在宿主。分析细菌群落与耐药基因的内在关联,共选择了7种优势菌群,其中大肠杆菌是主要的优势菌群,结果显示大肠杆菌与黏菌素类耐药基因、磷霉素类耐药基因、硝基咪唑类耐药基因、喹诺酮类耐药基因和利福平类耐药基因相关性最好,推测大肠杆菌可能是这几类抗生素耐药基因的宿主细菌,并发现Eubacterium limosum(粘液真杆菌)可能是多药耐药基因cfr(C)的宿主,需要后续实验验证。本研究通过高通量荧光定量PCR以及宏基因组测序技术均发现猪场及周边环境中均被多种耐药基因污染,尤其是氨基糖苷类、四环素类和MLSB类耐药基因相对丰度最高。进一步运用宏基因组测序技术对厌氧处理前后污水样品中耐药基因及菌群结构多样性及丰度进行分析,发现厌氧发酵处理后,总耐药基因相对丰度呈现降低,但是,部分耐药基因却呈现增加趋势;进一步探究菌群组成结构与ARGs的内在联系,发现这可能与厌氧发酵处理后菌群结构改变使部分细菌丰度增加所导致的。本研究为畜禽养殖环境中耐药性生态风险评估提供基础数据,同时为养殖环境中耐药基因流行分布监测以及重要耐药基因的溯源提供方法学参考。
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