目的:初步研究狭叶柴胡与其内生真菌间的交流,旨在阐明宿主植物对内生真菌上游信号转导途径相关信号分子的影响以及对下游内生真菌三萜皂苷合成途径关键酶基因表达的调控作用。方法:1.将悬浮细胞抽滤分离,制备得到细胞及细胞上清浓缩液,利用透析袋建立狭叶柴胡悬浮细胞与内生真菌的共培养模型。采用酶解法制备内生真菌原生质体,将宿主细胞及细胞上清液与原生质体互作,用流式细胞仪检测刺激后内生真菌胞内活性氧(ROS)水平的变化。2.分别将细胞、细胞上清液及共培养组交流培养4 d后,提取内生真菌中cAMP,cGMP,CaM,MAPK和CDPK,并检测该5个信号分子的含量变化,分析宿主植物对内生真菌上游信号转导通路的调节作用。同时提取交流后内生真菌的总RNA,利用Real-Time PCR(RT-PCR)检测交流前后内生真菌柴胡皂苷合成关键酶基因的表达变化。结果:狭叶柴胡宿主植物对其内生真菌的柴胡皂苷合成途径有一定的调控作用,但宿主植物并未提升内生真菌中ROS的水平。在细胞组中,内生真菌的5个信号分子cAMP、cGMP、CaM、MAPK和CDPK的含量均有不同程度的提升,且细胞对Ca2+相关的信号分子CaM和CDPK的作用显著,此外,对前三个关键酶基因HMGR、IPPI及FPS有一定程度的下调,而对下游SS、P450和GTs三个基因均有2倍左右的上调。在细胞液组中,除对cGMP有轻微抑制外,其他几个信号分子的水平均有一定程度的上调。除GTs外,整个柴胡皂苷合成途径中关键酶基因的表达均有上调,整体范围在1-3倍之内。而共培养组中,全部5个信号分子的含量均有所提升,且对cAMP、cGMP及MAPK的作用效果强于另外两组,对两个Ca2+相关信号分子的调控虽不是三组中最显著的,但调控水平与另两组差异较小。此外,对柴胡皂苷合成途径中全部关键酶基因的表达均有不同程度上调,其中最有意义的是,对最后一步柴胡皂苷元向柴胡皂苷转化步骤所需的关键酶基因GTs上调了近73倍。结论:本实验研究了狭叶柴胡宿主植物对其内生真菌柴胡皂苷合成途径的调控作用。结果表明不同宿主诱导子对内生真菌均有一定的调控,但具体通路的激活和基因的表达上有一定的差异。共培养组激活上游各个不同的通路,可能通过激活cAMP-PKA-MAPK通路,cGMP-PKG通路和Ca2+相关的CaM及CDPK通路等进行调控,进而实现了对内生真菌柴胡皂苷合成全部关键酶基因的表达调控,且均为正调控。这是由于共培养组中内生真菌同时与细胞及细胞液进行充分交流,最类似植物与内生真菌的体内环境,因此调控效果较为显著。其中SS和GTs上调最为显著,高达70倍左右。这就表明了共培养模型是体外模拟体内环境来获取活性成分的最佳培养方式,尤其是最后一步合成柴胡皂苷的关键酶基因GTs上调了近73倍,这就说明在交流过程中,宿主植物对内生真菌次代产物的合成有一定的诱导和调节作用,同时也解释了为何在脱离宿主植物后,内生真菌的这种产与宿主相同活性成分的能力有所下降甚至消失。本实验也证明了该共培养模型的实用性,为以后利用内生真菌大规模发酵生产柴胡皂苷奠定了实验模型,也为后续进一步诠释内生真菌代谢调节机制和研究内生真菌与宿主间的交流调控奠定坚实的理论基础。