AO-I阻断人EOC细胞MD2/TLR4复合物介导的PTX/MyD88/NF-κB耐药信号通路

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目的:本研究的目的在于探讨白术内酯I(AO-I)下调紫杉醇诱导的MyD88+人卵巢癌细胞skov3促炎症细胞因子IL-6、VEGF、Survivin表达的作用机制。方法:1、用流式细胞术检测紫杉醇(PTX)、脂多糖(LPS)、白术内酯I(AO-I)、AO-I联合紫杉醇、AO-I联合LPS诱导SKOV3细胞6h后TLR4/MD2二聚体的形成。2、分别用固定浓度白术内酯I、不同浓度的紫杉醇(PTX)、固定浓度的白术内酯I联合不同浓度紫杉醇诱导人卵巢癌MyD88+SKOV3细胞24h后,应用蛋白质免疫印迹分别检测蛋白样品中NF-κB P65和磷酸化P65在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达。3、分别用固定浓度白术内酯I、固定浓度的PTX、固定浓度的LPS、白术内酯I联合紫杉醇、白术内酯I联合脂多糖诱导人卵巢癌MyD88+SKOV3细胞和MyD88-A2780细胞6h、12h、24h,应用蛋白质免疫印迹分别检测蛋白样品中NF-ΚB P65和磷酸化P65在人卵巢癌细胞SKOV3和A2780中的表达。4、用流式细胞术检测PTX、LPS、白术内酯I、AO-I联合紫杉醇、AO-I联合LPS诱导SKOV3/A2780细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布的比例。5、运用统计软件SPSS17.0对数据进行统计学分析。结果:1、流式细胞术检测浓度为2μmol/L、10μmol/L PTX、LPS(1μg/ml)、AO-(I100μmol/L)、AO-I联合PTX(2μmol/L、10μmol/L)、AO-I联合LPS诱导SKOV3细胞6h后TLR4/MD2二聚体形成:与空白组相比,LPS组诱导培养后,二聚体形成量增多,有统计学意义(P<0.05),AO-I组诱导培养后二聚体形成量减少,有统计学意义(P<0.05),PTX组分别以2μmol/L、10μmol/L诱导培养后二聚体形成量增多,有统计学意义(P<0.05);AO-I联合LPS组与单药LPS组相比,二聚体形成量减少,有统计学意义(P<0.05),AO-I分别与PTX2μmol/L、10μmol/L联合诱导培养后与相应浓度单药PTX组相比,二聚体形成量减少,有统计学意义(P<0.05)。2、固定浓度AO-I100μmol/L诱导培养人卵巢癌MyD88+SKOV3细胞24h,NF-κBP65磷酸化水平比空白组低,有统计学意义(P<0.05);不同浓度PTX0.01μmol/L、0.02μmol/L、0.05μmol/L,NF-κB P65磷酸化水平比空白组高,有统计学意义(P<0.05);白术内酯I联合不同浓度紫杉醇,NF-κB P65磷酸化水平与紫杉醇组相比,明显下调。3、固定浓度的AO-I100μmol/L、PTX0.01μmol/L、LPS1μg/ml、AO-I联合PTX、AO-I联合LPS,诱导人卵巢癌MyD88+SKOV3细胞6h、12h、24h,结果显示:AO-I组,NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的空白组低,有统计学意义(P<0.05)。 LPS组,NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的空白组高,有统计学意义(P<0.05)。PTX组, NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24比相应时间点的空白组高,有统计学意义(P<0.05)。AO-I联合LPS组与LPS组比较,NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的LPS组低,有统计学意义(P<0.05)。 AO-I联合PTX组与PTX组比较,NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的PTX低,有统计学意义(P<0.05)。药物诱导人卵巢癌MyD88-A2780细胞6h、12h、24h,结果显示:AO-I组、LPS组,NF-κB P65磷酸化水平与空白组相比,无统计学意义(P>0.05)。PTX组与空白组比较,NF-κB P65磷酸化水平比空白组低,有统计学意义(P<0.05)。AO-I联合LPS组与LPS组比较,NF-κB P65磷酸化水平无统计学意义(P>0.05)。AO-I联合PTX组与PTX组比较, NF-κB P65磷酸化水平无统计学意义(P>0.05)。4、流式细胞术检测PTX(0.01μmol/L)、LPS(1μg/ml)、AO-I(100μmol/L)、AO-I联合紫杉醇、AO-I联合LPS诱导SKOV3细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布:药物诱导细胞后12h和24h,单药AO-I组比空白组G2/M期比例降低,单药PTX组、LPS组比空白组G2/M期比例升高,AO-I联合PTX组、AO-I联合LPS组分别比单药PTX组、LPS组G2/M期的比例降低;作用12h与作用24h相比,AO-I组24h比12h G2/M期的比例降低,PTX组24h比12h G2/M期的比例升高, LPS组24h比12h G2/M期的比例升高, AO-I联合LPS组24h比12h G2/M期的比例降低, AO-I联合PTX组24h比12h G2/M期的比例降低。说明AO-I在SKOV3细胞有阻止PTX/LPS诱导的细胞进入分裂期作用。药物诱导A2780细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布的比例显示:不同的实验组G2/M期时相分布的比例无明显差异(P>0.05),相同的实验组不同的时间点无明显差异(P>0.05)。结论:1、紫杉醇(PTX)2μmol/L、10μmol/L诱导SKOV3细胞6h后能形成TLR4/MD2二聚体,AO-I100μmol/L联合紫杉醇组,AO-I能下调紫杉醇诱导的TLR4/MD2二聚体形成。2、 AO-I能下调TLR4/MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞的NF-κB P65磷酸化表达,AO-I联合紫杉醇组,AO-I能下调紫杉醇诱导的TLR4/MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞NF-κB P65磷酸化表达。而AO-I不能下调MyD88-卵巢癌A2780细胞NF-κB P65磷酸化表达。3、AO-I能阻止MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞进入分裂期,增强紫杉醇对卵巢癌细胞有丝分裂的阻止作用。
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