研究背景和目的高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见的卵巢上皮恶性肿瘤之一,约占卵巢浆液性癌的90%,由于缺乏有效的早期筛查手段,导致多数患者在就诊时已是晚期,手术及化疗等治疗效果不佳,因此,HGSOC死亡率仍高居妇科恶性肿瘤之首,5年生存率低于30%。目前认为卵巢上皮性癌组织学起源具有多样性,HGSOC可能起源于输卵管上皮细胞,分子遗传学特征以TP53和BRCA1/2基因突变较常见。但是我们对于HGSOC的起源组织、病因和发展进程以及流行病学特征的认识并不完善,已知的分子调控机制也没有明显改善目前诊治的现状。鉴于HGSOC的高死亡率,明确其发病机制以及寻找新的治疗靶点成为妇科肿瘤研究中一项重要的内容。t RNA衍生片段(t RFs)是一类来源于前体和成熟t RNA,不能编码蛋白质,大小在14-50个核苷酸的小分子RNA。t RFs主要有六种类型:ti RNA-5,ti RNA-3,t RF-5,t RF-3,t RF-1和it RF。随着对t RFs的认识逐渐深入,研究发现t RFs具有独特的结构特征和特定的来源模式,因而学者不再简单地认为t RFs是随机降解的产物。研究发现t RFs在多种疾病,例如人非小细胞肺癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌等癌症的发生发展中发挥着重要的调控作用,但是目前已经报道的关于t RFs对HGSOC影响的研究并不多。鉴于t RFs在其他癌症中的关键调控作用,我们意识到t RFs或许是HGSOC发病机制中的关键调节因子。因此,研究t RFs在卵巢癌中的作用具有重要的临床意义。本研究旨在通过高通量测序技术筛查与HGSOC相关的t RFs,并研究关键t RFs在SK-OV-3卵巢癌细胞系中的功能和机制,为HGSOC的早期诊断和治疗提供理论依据和新的靶点。研究方法第一部分:使用small RNA测序方法筛选HGSOC相关的t RFs:(1)收集3个HGSOC患者和3个健康捐赠者的血清样品,提取总RNA,构建c DNA文库,并进行small RNA测序。(2)使用生物信息学的方法分析测序结果,对差异表达的t RFs进行GO功能分析和KEGG代谢途径分析。(3)为验证测序结果的可靠性,选取3个差异表达的t RFs扩大血清样本行荧光定量PCR(q RT-PCR)实验验证。筛选出候选基因并分析基因表达量与临床特征间关系。第二部分:t RF-03357促进卵巢癌细胞的生物学功能研究:(1)使用q RT-PCR验证t RF-03357和t RF-03358在HOSEPIC,卵巢癌细胞SK-OV-3及HO8910中表达量,确定最终目的基因为t RF-03357。(2)将t RF-03357 inhibitor/NC,t RF-03357 mimics/NC,分别转染至卵巢癌细胞系SK-OV-3和人卵巢上皮细胞(HOSEPIC),用于后续实验。(3)使用q RT-PCR检测转染后的SK-OV-3和HOSEPIC细胞中t RF-03357的表达。(4)使用CCK-8方法检测转染后的SK-OV-3和HOSEPIC细胞的增殖能力。(5)使用Transwell实验检测转染后的SK-OV-3和HOSEPIC细胞的迁移和侵袭能力。(6)使用TUNEL实验检测转染后的SK-OV-3和HOSEPIC细胞的凋亡情况。第三部分:t RF-03357通过调控HMBOX1促进卵巢癌的机制研究:(1)在线预测t RF-03357的5个靶基因,q RT-PCR检测转染t RF-03357 inhibitor/NC后SK-OV-3细胞中5个靶基因的表达情况。选出差异最显著的候选基因HMBOX1。(2)Western blotting(WB)检测分别转染t RF-03357 inhibitor/NC,t RF-03357mimics/NC后SK-OV-3细胞中HMBOX1蛋白的表达水平。(3)免疫组织化学检测卵巢癌组和正常卵巢组HMBOX1表达。(4)双荧光素酶报告基因实验验证HMBOX1和t RF-03357之间的作用关系,将HMBOX1野生型报告载体和HMBOX1突变型载体(t RF-03357结合位点突变)分别与t RF-03357 mimics/NC共转染293 T细胞,然后检测荧光信号。(5)将HMBOX1 si RNA-1、si RNA-2和si RNA-3序列转染至SK-OV-3细胞,用q RT-PCR检测转染si RNA后HMBOX1的表达水平,筛选出干扰效果最好的si RNA-1,用于后续实验。(6)用CCK-8法和Transwell实验检测抑制HMBOX1表达后的SK-OV-3细胞增殖、迁移和侵袭能力。(7)拯救实验:将inhibitor NC,t RF-03357 inhibitor,t RF-03357 inhibitor+HMBOX1 si RNA-1三组分别转染SK-OV-3细胞,使用CCK-8法和Transwell实验检测转染后SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。实验结果第一部分:测序筛选HGSOC相关的t RFs结果如下:(1)small RNA测序平均获得890万个clean reads,占比85.85%,6个测序文库的GC含量在49-52%之间。数据库比对发现平均得到977,309个读数的t RFs,并从中鉴定出27个差异表达的t RFs,其中有22个在HGSOC组织上调表达,5个下调表达。(2)对差异表达的t RFs进行靶基因预测并分析其功能。结果发现,差异表达的t RFs主要富集的GO条目是蛋白质磷酸化,KEGG通路分析表明差异表达的t RFs主要参与调控MAPK信号通路,癌症通路和Wnt信号通路。(3)q RT-PCR验证结果表明,与健康对照组相比,t RF-03357和t RF-03358的表达水平在HGSOC患者显著上调,但是t RF-07650的表达却没有表现出显著性差异。差异t RF表达量与卵巢癌患者临床特征的分析表明t RF-03357的表达水平与CA125(P=0.0180)相关。第二部分:t RF-03357促进卵巢癌细胞的生物学功能研究结果:(1)qRT-PCR进一步验证t RF-03357和t RF-03358在正常卵巢上皮细胞HOSEPIC,卵巢癌细胞SK-OV-3及HO8910中的表达量,结果显示与HOSEPIC细胞相比,t RF-03357和t RF-03358在SK-OV-3和HO8910细胞中的表达量显著升高,并且t RF-03357的变化倍数要高于t RF-03358。因此,t RF-03357作为候选目标用于后续实验。(2)q RT-PCR检测结果显示转染t RF-03357 inhibitor的SK-OV-3细胞中t RF-03357的表达量低于NC组,转染t RF-03357 mimics的HOSEPIC细胞中t RF-03357的表达量高于NC组,表明转染效果可靠。(3)CCK-8实验结果显示转染t RF-03357 inhibitor的SK-OV-3细胞的增殖能力低于NC组,转染t RF-03357 mimics的HOSEPIC细胞的增殖能力高于NC组,表明t RF-03357可以促进细胞增殖。(4)Transwell实验显示转染t RF-03357 inhibitor的SK-OV-3细胞的迁移和侵袭能力低于NC组,转染t RF-03357 mimics的HOSEPIC细胞的迁移和侵袭能力高于NC组。表明t RF-03357可以促进细胞迁移和侵袭。(5)TUNEL实验结果显示各组间细胞的凋亡差异不显著,表明t RF-03357不影响细胞的凋亡。第三部分:t RF-03357通过调控HMBOX1促进卵巢癌的机制研究的结果(1)qRT-PCR检测结果显示,与NC组相比,转染t RF-03357 inhibitor后,SK-OV-3细胞中HMBOX1的表达水平显著提高,而PKN2,KLF3,PTPN13和ESR2的表达水平没有显著改变。q RT-PCR进一步研究发现,转染t RF-03357 mimics的SK-OV-3细胞中HMBOX1基因表达水平显著下调,说明t RF-03357下调HMBOX1基因的表达。(2)WB实验结果显示转染t RF-03357 inhibitor的SK-OV-3细胞中HMBOX1蛋白的表达量显著高于NC,转染t RF-03357 mimics的SK-OV-3细胞中HMBOX1蛋白的表达水平显著低于NC组,说明t RF-03357下调HMBOX1蛋白的表达。(3)双荧光素酶报告基因实验结果显示t RF-03357能够抑制HMBOX1的荧光活性,但对结合位点突变的HMBOX1没有显著影响。(4)免疫组化实验显示,与正常组织相比,肿瘤组织中HMBOX1的表达明显降低。(5)HMBOX1si RNA-1,si RNA-2和si RNA-3转染至SK-OV-3细胞后的q RT-PCR检测结果显示,si RNA-1组中HMBOX1的表达水平下降最显著,表明si RNA-1干扰效果最好,可用于后续实验。(6)转染HMBOX1si RNA-1至SK-OV-3细胞后CCK-8法和Transwell实验结果显示,与NC组相比,转染HMBOX1si RNA-1后的SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力都显著升高,说明HMBOX1抑制SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭。(7)拯救实验:结果显示抑制t RF-03357表达,可以显著降低SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭,而同时转染HMBOX1si RNA则显著逆转这些作用。表明t RF-03357通过HMBOX1调控SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭。结论本研究通过高通量测序获得了HGSOC的t RFs表达谱,首次筛选出一个在HGSOC患者血清中表达上调的新的小分子RNA(t RF-03357)。t RF-03357通过靶向和下调HMBOX1的表达,促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。t RF-03357在HGSOC发生发展中发挥着重要功能,可能成为诊断和治疗卵巢癌的一个新的潜在靶点。