【摘 要】
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植物U-box（PUB）蛋白家族在植物生长和发育过程中占有重要地位,在十字花科SRK信号传导过程中,含有U-box区域的下游底物ARC1已被证实参与甘蓝的SI反应,但其唯一性一直还存在较大争议,研究者们也不断提出其他各类下游底物,其中不乏由ARC1的同源基因PUB蛋白家族构成的SRK-PUB途径假说。而目前U-box蛋白家族在甘蓝中却仍然停留在单基因分析或不完整的基因组分析阶段,缺少基于整个基因组
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植物U-box（PUB）蛋白家族在植物生长和发育过程中占有重要地位,在十字花科SRK信号传导过程中,含有U-box区域的下游底物ARC1已被证实参与甘蓝的SI反应,但其唯一性一直还存在较大争议,研究者们也不断提出其他各类下游底物,其中不乏由ARC1的同源基因PUB蛋白家族构成的SRK-PUB途径假说。而目前U-box蛋白家族在甘蓝中却仍然停留在单基因分析或不完整的基因组分析阶段,缺少基于整个基因组的系统化研究。本文首次对甘蓝U-box蛋白家族进行了系统的全基因组鉴定、表达及功能分析,并在筛选出的36个SI相关候选基因中选择BoPUB8进行了克隆与表达分析。主要研究结果如下:1.甘蓝U-box蛋白家族全基因组鉴定、分布及表达分析（1）对甘蓝U-box家族进行了搜索鉴定,删除了4个明显不含U-box结构的蛋白序列（Bol019081、Bol018658、Bol011584、Bol045810）,最终筛选出99个甘蓝U-box基因,同时还获得了60个与BoPUB同源的At PUB基因;（2）将最终检索出的BoPUB基因分为7组（Ⅰ-Ⅶ）,并依此命名为BoPUB1-BoPUB99;（3）通过基因组共线性分析,筛选出24对甘蓝基因组内串联重复基因及甘蓝和拟南芥基因组间的39对串联重复基因;（4）计算了串联复制基因（组内和组间）的非同义突变率（Ka）和同义突变率（Ks）比值,组内的24对串联基因的Ka/Ks值在0.09-0.65之间,组间的39对串联基因的Ka/Ks值在0.04-0.50,表明U-box蛋白家族成员在长期进化的过程中进行了纯化选择;（5）确定了BoPUB蛋白家族成员的15个保守基序,长度为8-50种氨基酸不等;（6）甘蓝U-box基因家族的结构域包含众多RING-finger结构域和U-box结构域,表明甘蓝U-box家族基因具有丰富的E3连接酶特性;（7）BoPUB基因各染色体上的数目分布不均,C3染色体上分布的基因最多达21条,揭示了甘蓝U-box家族基因的复杂多样性;此外C3、C4、C5、C7、C8、C9染色体中均存在较多基因簇,表明这些属于同一个祖先的基因扩增产物;（8）蛋白互作揭示23个拟南芥PUB基因与45个甘蓝PUB基因有相互作用,这些基因均具有催化活性且与蛋白质的泛素化过程有关;（9）GO注释和KEGG通路分析发现,共有1689个GO-terms显著富集,主要包括生物过程、细胞组分和分子功能三个类别,部分基因主要参与泛素介导的蛋白水解、剪接和内质网中蛋白质加工三种途径;（10）利用RNA-seq数据,采取FPKM值量化了这103个基因的表达水平,并筛选出36个甘蓝SI相关候选基因,通过RT-q PCR检测了36个候选基因的时空表达水平;（11）在36个候选基因启动子中检测到几种主要调节元件包括:激素相关调节元件（ABRE、ERE）、花粉特异性顺式调节元件POLLENlat52、脱水反应相关作用元件MYC、压力与防御相关的调节元件W-box等,揭示了这些候选基因可以对不同的生物或非生物胁迫作出反应,且与甘蓝花粉发育关系密切。2.甘蓝SI相关基因BoPUB8的克隆与分析（1）成功克隆出甘蓝SI相关蛋白BoPUB8基因,属于RING型E3泛素转移酶,编码区长约1356bp,编码451个氨基酸,分子量约50k Da,含有一个U-box结构与和一个Arm结构域;（2）亚细胞定位表明甘蓝BoPUB8定位于细胞质间,可能在甘蓝柱头细胞质间参与自交不亲和信号传导和调控;（3）酵母双杂交结果证明BoSRK28与BoPUB8之间存在直接相互作用关系;（4）qRT-PCR表明该基因具有时空表达特异性及组织表达特异性。BoPUB8在柱头中表达量最高,在雄蕊、花蕾和花萼中表达量略低,花瓣和子叶中的表达量最低;不论在自花授粉还是异花授粉条件下,BoPUB8基因参与调控并上调表达的关键时期均在授粉前期0min-30min内,BoPUB8在SP-15min时表达量激增呈显著表达;（5）GUS显色结果与不同组织的qRT-PCR检测结果基本一致,在花蕾中,柱头部分的表达量最高,其次是雄蕊、花萼和花瓣。
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