论文部分内容阅读
第一部分纤维蛋白靶向纳米粒的制备、基本性质检测和生物安全性评价目的:制备一种由CREKA五肽修饰并包裹ICG的纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）,检测其纳米粒基本性质、稳定性及生物安全性。方法:采用薄膜水化-声震法制备CREKA五肽修饰的脂质外壳并包裹ICG的纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）;光镜及透射电镜观察纳米粒的形态和结构;使用Malvern粒径仪检测纳米粒的粒径、表面电位、聚合物分散指数（Polymer dispersity index,PDI）及稳定性;紫外分光光度计检测ICG,CREKA-LIP NPs和CREKA-ICG-LIP NPs溶液的紫外光谱图,计算靶向纳米粒中ICG的包封率（Encapsulation efficiency,EE）;采用CCK-8法检测不同浓度CREKA-ICG-LIP NPs对H9C2细胞的毒性;检测对照组和注射纳米粒1天、3天、7天14天组SD大鼠（n=5只/组）的血常规和血生化指标,HE染色观察对照组及14天组重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行安全性评价。结果:靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs外观呈暗绿色混悬液;光镜及透射电镜下观察CREKA-ICG-LIP NPs呈球形,大小均匀,分散性好;Malvern粒径仪检测CREKA-ICG-LIP NPs纳米粒平均粒径及PDI分为260.77±9.00nm（PDI=0.138）,表面电位分别为-30.50±0.78 m V,纳米粒的平均粒径随时间变化的差异无统计学意义（P<0.05）;ICG的标准曲线为:Y=0.1538X+0.0607（R~2=0.9957）,纳米粒ICG的EE为86.72%;CCK-8法检测纳米粒处理后细胞活性均在90%以上;与对照组血常规及血生化指标相比,实验组指标无异常升高,14天组重要脏器HE切片无明显病理改变。结论:本研究通过薄膜水化-声震法成功制备了靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs,纳米粒具有大小均一、分散性较好、稳定性强及生物安全性高等特点。第二部分纤维蛋白靶向纳米粒靶向能力及体内分布的实验研究目的:建立并验证心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）模型,评价靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）的体内外靶向能力并观察体内分布情况。方法:通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支-移除结扎线的方式建立IR模型,使用心电图、TTC染色、HE染色及Masson染色等方法验证模型制备;体外靶向实验,分别将带有DiI的靶向纳米粒CREKAICG-LIP/DiI NPs、非靶向纳米粒ICG-LIP/DiI NPs及PBS溶液与纤维蛋白膜共孵育,观察荧光信号情况;体内靶向实验,6只IR和6只NC的SD大鼠随机分为:NC靶向组、NC非靶向组、IR靶向组及IR非靶向组（n=3只/组）,尾静脉注射纳米粒溶（CREKA-ICG-LIP/DiI NPs or ICG-LIP/DiI NPs,1ml,4mg/ml）,制备心脏冰冻切片,观察纳米粒和纤维蛋白分布及共定位情况;体内分布实验,靶向荧光纳米粒通过尾静脉注射到SD大鼠体内,分别在注射后1、6及24h取SD大鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）制作冰冻切片观察纳米粒分布情况。结果:IR模型结扎后心电图显示Ⅲ导联ST段抬高,术后TTC染色存在心肌缺血区,术后3周HE染色及Masson染色存在心肌纤维化,提示IR模型成功建立;体外靶向实验发现,靶向组比非靶向组及PBS组纤维蛋白膜荧光信号强;体内靶向实验发现,与NC组相比IR组损伤区纤维蛋白信号更强（P<0.0001）,与IR非靶向组相比IR靶向组发现大量纳米粒信号（P<0.0001）且纳米粒与纤维蛋白有良好的共定位;体内分布实验发现,循环1h后,肝脏和脾脏出现较弱荧光信号,循环6h,肝脏和脾脏信号强度增加,肾脏出现微弱荧光信号,循环24h,肝、脾和肾荧光信号较前均降低,心肺未见明显信号。结论:靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs与纤维蛋白结合能力强,体内实验发现其能通过血管内皮间隙,有效的与心肌损伤区出现的纤维蛋白结合,证实CREKA-ICG-LIP NPs纳米粒具有良好的体内外靶向能力;纳米粒体内分布主要出现在肝、脾及肾,表明其经过肝-脾系统代谢及肾脏排泄。第三部分纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究目的:制备纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）,评价其用于检测心肌梗死区的光声成像的效果。方法:体外光声成像实验,使用光声成像仪在680nm-970nm扫描CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）纳米粒溶液,确定最佳激发波长;采集不同浓度CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,0-400μg/ml）、CREKA-LIP NPs（2mg/ml）及PBS溶液的光声图像,并使用系统软件测量每个感兴趣区ROI（region of interest,ROI）的光声信号值;收集CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）随时间延长（0、4、8、12h）的光声图像并测量光声信号值以检测纳米粒光声稳定性;体内光声成像实验,制6只IR模型大鼠并随机分为:靶向组和非靶向组（n=3只/组）,经尾静脉注射靶向或非靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs或ICG-LIP NPs,1ml,4mg/ml）,收集其在手术前、手术后、注射后0min及注射后60min心脏区域的光声图像并测量光声信号强度,图像收集完毕后,取心脏进行TTC染色。结果:体外光声成像实验发现,835nm是CREKA-ICG-LIP NPs光声成像的最佳激发波长;未包裹ICG的纳米粒（CREKA-LIP NPs）及PBS溶液无光声信号,而包裹ICG的纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）有光声信号出现,其光声信号强度与纳米粒浓度有良好的线性关系,线性回归方程:Y=0.0068X+0.0983（R~2=0.9943）,且CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）的光声信号强度不会随时间推移而改变;体内光声成像实验发现,靶向组和非靶向组大鼠术前和术后心脏区域均未观察到光声信号,纳米粒体内循环60min后,靶向组的心脏前壁区域发现有光声信号存在,而非靶向组心脏前壁区域未见光声信号,靶向组比非靶向组光声信号值有统计学意义上升高（P<0.0001）,TTC染色观察靶向组与非靶向组均存在心肌缺血区。结论:纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）体外激发后可以产生光声信号并具有良好光声稳定性,体内循环后可通过损伤区增宽的血管内皮间隙到达心肌损伤区,并与纤维蛋白结合实现对损伤区特异性的光声成像。