目的尘肺病是我国职业病中占比例最多的疾病,一直以来影响着发病者的生活质量和社会的经济发展,而游离SiO2粉尘致肺纤维化作用最强,矽肺也是尘肺中进展最快、死亡率最高的一种之一。长期以来,人们对矽肺进行了大量研究,但是其发病机制仍不清楚,因而缺乏有效的早期诊断、动态观察的生物标志,也不能消除或逆转肺组织纤维化。随着表观遗传学的研究和发展,表观遗传学调控可能是矽肺形成中成纤维细胞转分化的重要机制。本课题组前期研究在建立细胞共培养的矽肺体外模型基础上,通过高效液相色谱法对矽肺中肺成纤维细胞DNA甲基化进行了研究,发现整体甲基化程度降低,因此认为DNA甲基化改变可能是矽肺发生发展的一种调控方式。但并未进行甲基化特异性位点的探索和研究,而相关研究也尚未见报道。因此,该研究采用DNA甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术对SiO2所致肺成纤维细胞转分化过程中可能存在的DNA甲基化差异基因进行检测,并探讨其可能的机制,为进一步研究其表观遗传学调控机制提供实验基础。方法本次实验中采取组织块法提取雄性SD大鼠的肺成纤维细胞进行原代培养,培养至6-8代时转移至6孔板中。采用肺泡灌洗术提取雄性SD大鼠的肺泡巨噬细胞。使用transwell对肺成纤维细胞和肺泡巨噬细胞进行共培养,肺成纤维细胞在下层,巨噬细胞在transwell之上,建立矽肺体外模型。使用100μg/ml的SiO2的工作液对共培养模型的巨噬细胞进行染毒处理,分别在0h(A1)、24h(A2)、48h(A3)收取成纤维细胞。采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取成纤维细胞的DNA。采用DNA甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术对不同组的DNA进行DNA甲基化的检测,测序所得到的数据经过初步的筛选和处理之后用于后续的分析。分别对测序所得reads和高甲基化区域扫描peak进行统计描述和基因元件分布的描述。进一步的对差异甲基化区域和差异基因进行统计,并使用DAVID工具对DNA甲基化差异基因进行GO和KEGG pathway的生物信息学分析。使用亚硫酸氢盐测序的方法对MeDIP-seq的结果进行验证。结果1.medip-seq数据分析发现分别有26,048,428(60.90%)、34,162,578(61.53%)、33,314,252(60.18%)个reads比对到了大鼠的参考基因组上,进一步的分析发现,分别有22,192,364、28,930,222、28,256,146个reads比对到参考基因组的唯一位置上。基因组功能原件的分布分析发现,集中在基因间区的reads最多,其次是内含子和外显子等。2.扫描显著性的甲基化peak区域,分析结果发现,总共308,723个peak被扫描发现,在各组分别有208,253、206,685和232,504个peak扫描获得,分别有208,253、206,685、232,504个peak定位在了基因的功能元件上。在不同的功能元件上,在基因间区的peak数量最多,内含子次之。3.dna甲基化差异区域对应的唯一差异基因有16,292个,其中a1与a2的比较组中有13,311个,a2与a3的比较组中有13,753个,a1与a3的比较组中有13,381个,更深入的分析发现总共有8,791个基因被发现在三个差异组中都存在。4.dna甲基化差异基因的go分析发现这些差异基因主要集中在生物学过程、构成细胞的组分,实现的分子功能三个大的分类中。其中4,402个基因分类在生物学过程中,3,920个基因分类在细胞组成成份,4,290个基因分类在分子功能中。5.dna甲基化差异基因的keggpathway分析发现,这些差异甲基化基因主要富集在37个通路中,这37个通路按照其特征又归化为了5个大类的通路,包括新陈代谢、环境信息加工、细胞过程、生物体系统和人类疾病相关的通路。结论成纤维细胞转分化过程中涉及的dna甲基化改变的位点主要分布在基因的基因间区和内含子、外显子区域,启动子和基因下游区域很少。成纤维细胞转分化过程中存在大量dna甲基化程度发生改变的基因,这些基因的功能主要集中在与磷代谢相关的生物学过程、质膜相关的细胞组成成份和离子通道相关的分子功能中。成纤维细胞转分化过程可能与线粒体的能量活动有关;成纤维细胞转分化后形成肺纤维化的主要形式是成纤维细胞与细胞外基质的连接形成粘着斑;成纤维细胞转分化过程中有与突触形成相关基因的功能变化变化;成纤维细胞转分化过程与癌症形成有许多相似的过程,其中的MAPK、Wnt、ErbB、p53和TGF-β等通路可能在矽肺的形成中起到重要作用,值得进行进一步研究。