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目的:1、体外构建超分子聚合物水凝胶,检测其生物性能和机械性能。2、通过研究超分子聚合物水凝胶在生物体内外的相容性,探讨其作为角膜基质替代物材料的可行性,为超分子聚合物水凝胶角膜基质替代物的临床应用提供依据。方法:一、体外生物相容性实验研究1.兔角膜上皮细胞原代培养及鉴定。2.将兔角膜上皮细胞接种到超分子聚合物(PNAGA)水凝胶上,显微镜下观察角膜上皮细胞生长情况,并利用LIVE-DEAD细胞活性毒性检测试剂盒检测细胞活性。二、体内生物相容性实验研究1.将PNAGA水凝胶移植到活体兔软骨中,12周后处死兔子,取兔子软骨做苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining;HE)染色,观察水凝胶与兔软骨的生物相容性和炎症反应。2.将PNAGA水凝胶角膜基质替代物移植到活体兔角膜上,选取右眼为手术眼,左眼作为正常对照。实验采用两种手术方式将水凝胶角膜基质替代物植入术眼,即板层移植和角膜层间移植。分别于术后1天、3天、7天、15天、1月、3月进行肉眼和裂隙灯观察兔眼角膜有无免疫排斥反应,记录角膜透明度、角膜新生血管、角膜上皮化、植片水肿及结膜充血情况;于术后15天、3月行兔眼角膜共聚焦显微镜检查,观察角膜上皮生长情况和角膜内皮数量的变化,观察是否有细胞长入到水凝胶内;分别于术后1月、3月处死兔子,取兔子眼球行角膜苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining;HE)染色和角膜上皮细胞特异性标志蛋白CK3抗体AE5免疫组织化学检测。结果1.成功分离培养兔角膜上皮细胞,细胞免疫荧光鉴定结果为阳性,表明该细胞为角膜上皮细胞。角膜上皮细胞在PNAGA水凝胶上生长状态良好,细胞连接紧密。细胞活性毒性检测结果显示兔角膜上皮细胞在PNAGA水凝胶上存活率基本达100%,表明细胞具有良好的活性,PNAGA水凝胶无细胞毒性。2.12周后水凝胶在兔子软骨内性质稳定,没有引起周围组织的炎症反应,也没有与周围软骨组织融合在一起。未放入水凝胶的软骨缺损组织已经愈合。3.将PNAGA水凝胶移植到兔眼角膜,板层移植及角膜层间移植术后角膜及植片均保持透明,没有出现角膜溃疡和混浊,虹膜纹理及瞳孔清晰可见,无结膜充血情况,植片无水肿。角膜层间移植术后1月,可见有细小新生血管从植片上方爬到植片边缘。术后3月,新生血管继续生长,但仅为植片上方小部分。荧光素钠染色角膜,板层移植角膜植片部位全部着染,术后一直无角膜上皮细胞生长到PNAGA水凝胶角膜基质替代物表面。角膜层间移植仅切口部位轻微着染,无明显角膜上皮缺损。4.共聚焦显微镜观察板层移植术后,水凝胶表面没有角膜上皮细胞生长,上皮细胞通过植片与角膜组织间的缝隙爬到植片下面,在手术形成的角膜基质剖切面上重新角膜上皮化愈合,角膜上皮细胞生长良好,细胞间连接紧密。角膜内皮细胞数目变化无统计学意义。角膜层间移植术后,角膜上皮细胞没有出现明显的上皮细胞死亡及上皮细胞大片缺损。角膜内皮细胞数目变化无统计学意义。角膜基质中,在水凝胶下面的角膜基质上有角膜上皮细胞生长,细胞生长状态良好,彼此间连接紧密。5.HE染色PNAGA水凝胶呈紫色均匀物质,表面和内部无细胞生长,PNAGA水凝胶与周围角膜组织处于彼此分离的状态,角膜组织无明显水肿以及炎症细胞浸润。植片下面角膜组织表面已经上皮化修复,细胞呈矮柱状整齐排列,角膜层间移植术后,可见基质内水凝胶下面的角膜组织表面已经上皮化修复,细胞形态正常且整齐排列。6.角膜上皮细胞特异性标志蛋白CK3抗体AE5免疫组织化学检测,板层移植术后1月及3月,可见PNAGA水凝胶角膜基质替代物下方的角膜组织上已经上皮化修复,细胞形态正常且整齐排列。角膜层间移植术后1月及3月,可见基质内水凝胶下面的角膜组织表面已经上皮化修复,细胞形态正常且整齐排列。结论1.实验所用超分子聚合物水凝胶的成分为多聚丙烯酰基甘氨酰胺(Poly N-acryloyl glycinamide,PNAGA),是甘氨酸的衍生物,结构简单不含交联剂。PNAGA水凝胶材料具有许多优点。2.研究采用组织块细胞培养法,可获得形态及性状稳定的兔角膜上皮细胞。同时细胞活性毒性检测显示细胞在PNAGA水凝胶存活率基本达100%,说明PNAGA水凝胶不会对细胞产生毒性反应。PNAGA水凝胶体外生物相容性良好,为其在动物实验体内相容性的研究奠定了基础。3.PNAGA水凝胶首次作为角膜基质替代物材料应用在角膜上,它的物理性质和化学性质都非常稳定,没有发生降解也不引起周围角膜组织的炎症反应和免疫排斥反应。PNAGA水凝胶始终与角膜组织处于彼此独立的状态,角膜上皮细胞不在水凝胶表面生长。因此我们认为PNAGA水凝胶为生物惰性材料。接下来将对材料进行改进,使细胞便于粘附,并提高其体内生物相容性。