论文部分内容阅读
目的：血管性痴呆（VD）是指脑血管疾病导致的严重认知功能障碍临床综合征。脑血管病患者常并发认知功能障碍，甚至发生痴呆,随着社会人口老龄化和脑卒中治疗存活率的提高，VD的发病率逐年升高，仅次于阿尔茨海默病,已成为严重影响人类生活质量的疾病之一。近年来研究表明，在中枢神经系统p38MAPK通路的激活可导致细胞死亡，与脑缺血损伤有密切关系，p38MAPK被磷酸化激活后，其磷酸化底物是活化转录因子(ATF-2，Elk-1,NF-KB等)，还可活化MAPrC激活蛋白激酶，磷酸化的p38MAPK使效应细胞分泌多种细胞因子和花生四烯酸代谢产物，参与介导神经细胞损伤的过程。本研究旨在了解血管性痴呆大鼠海马组织中p38MAPK及p-p38MAPK的变化，以探讨VD与氧化损伤的关系，并进一步探讨普罗布考对VD模型大鼠智能改善的情况及海马区p38MAPK及p-p38MAPK的影响，为临床使用普罗布考治疗VD提供实验依据。方法：选取健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，将大鼠随机分为假手术组、模型组、普罗布考组，每组10只。对大鼠采用双侧颈总动脉永久性结扎的方法，造成慢性脑灌注不足所致VD模型。VD动物模型的筛选标准：术后7天对各组大鼠进行Morris水迷宫试验训练1天，以假手术组大鼠平均逃避潜伏期的均值为参考值，计算手术组大鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占平均逃避潜伏期的比例，该值>20%定为痴呆鼠。普罗布考组给予普罗布考500mg/kg/d灌胃，假手术组与模型组给予等体积羧甲基纤维素钠灌胃。灌胃8周后，开始为期5天的Morris水迷宫实验：前4天为定位航行试验，记录平均逃避潜伏期。第5天进行空间搜索试验，记录大鼠穿越原平台次数。水迷宫实验结束后，取材，采用光镜观察各组大鼠海马CA1区的形态学变化；用western blot方法和免疫组织化学染色方法测定海马区p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达变化。结果:1行为学测定1.1逃避潜伏期结果第1-4天测定的逃避潜伏期时间代表大鼠的学习能力，逃避潜伏期时间越短学习能力越强。三组大鼠的逃避潜伏期时间均随训练天数的增加而缩短，说明训练可以增强学习能力，而各组大鼠的学习能力却存在差异，模型组与假手术组相比，第1-4天模型组大鼠的逃避潜伏期时间均延长（P﹤0.05）；普罗布考组与模型组相比，第1天大鼠的逃避潜伏期时间无显著差异（P﹥0.05），第2-4天普罗布考组大鼠的逃避潜伏期时间明显缩短（P﹤0.05）；普罗布考组与假手术组相比，第1-4天大鼠的逃避潜伏期时间均无显著差异（P﹥0.05）。1.2穿越平台次数结果第5天测定的穿越平台次数表示大鼠的记忆能力，穿越平台次数越多记忆能力越强。模型组与假手术组相比，模型组大鼠穿越平台次数明显减少（1.75±1.14VS5.58±1.83,P﹤0.05）；普罗布考组与模型组相比，普罗布考组大鼠穿越平台次数明显增多（4.50±1.38VS1.75±1.14,P﹤0.05）；普罗布考组与假手术组相比，两组大鼠穿越平台次数无显著差异（4.50±1.38VS5.58±1.83,P﹥0.05）。2普罗布考对血管性痴呆大鼠海马区p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表达的影响2.1western blot结果2.1.1海马区p38MAPK蛋白的表达情况模型组与假手术组相比，模型组大鼠海马区p38MAPK蛋白的表达水平无明显变化（1.711±1.923VS1.728±2.045,P>0.05）；普罗布考组与模型组相比，普罗布考组大鼠海马区p38MAPK蛋白的表达水平无明显变化（1.835±2.139VS1.711±1.923,P>0.05）；普罗布考组与假手术组相比，两组大鼠海马区p38MAPK蛋白的表达水平无明显差异（1.835±2.139VS1.728±2.045,P﹥0.05）。2.1.2海马区p-p38MAPK蛋白的表达情况模型组与假手术组相比，模型组大鼠海马区p-p38MAPK蛋白的表达水平明显增高（2.59±0.243VS0.35±0.586,P﹤0.05）；普罗布考组与模型组相比，普罗布考组大鼠海马区p-p38MAPK蛋白的表达水平明显降低（0.54±0.049VS2.59±0.243,P﹤0.05）；普罗布考组与假手术组相比，两组大鼠海马区p-p38MAPK蛋白的表达水平无明显差异（0.54±0.049V0.35±0.586,P﹥0.05）。2.2免疫组织化学染色结果2.2.1大鼠海马CA1区p38MAPK蛋白表达的阳性细胞情况模型组与假手术组相比，模型组大鼠海马CA1区p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数无明显改变（30.00±1.0VS28.00±2.0,P>0.05）；普罗布考组与模型组相比，普罗布考组大鼠海马CA1区p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数无明显改变（29.00±1.732VS30.00±1.0,P>0.05）；普罗布考组与假手术组相比，两组大鼠海马CA1区p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数无明显差异（29.00±1.732VS28.00±2.0,P﹥0.05）。2.2.2大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白表达的阳性细胞情况模型组与假手术组相比，模型组大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数明显增多（25.33±2.08VS9.0±1.0,P﹤0.05）；普罗布考组与模型组相比，普罗布考组大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数明显减少（15.11±7.87VS25.33±2.08,P﹤0.05）；普罗布考组与假手术组相比，两组大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白表达的阳性细胞数无明显差异（15.11±7.87VS9.0±1.0,P﹥0.05）。3海马神经细胞形态学观察假手术组海马CA1区神经细胞层结构紧密，神经细胞核完整，胞浆丰富。模型组海马CA1区的细胞排列紊乱,神经细胞数明显减少，许多细胞变得不完整，有的形成碎片,基质疏松及微空泡形成。普罗布考组海马CA1区的形状与正常接近，大脑海马区细胞排列紧密，层次丰富，细胞数明显多于模型组，神经细胞完整，胞浆丰富，可见少量变性细胞。结论：1采用大鼠双侧颈总动脉永久性结扎的方法可以建立理想的VD动物模型。2VD大鼠海马中存在细胞凋亡通路蛋白的表达异常，提示细胞凋亡机制参与了血管性痴呆的发病过程。3普罗布考可以提高VD大鼠学习记忆能力，改善VD大鼠的认知功能。4普罗布考可能通过抑制VD大鼠海马区p38MAPK蛋白的磷酸化，从而抑制神经元的凋亡来发挥保护神经元的作用。