尼龙12是脂肪族聚酰胺的重要代表之一,由于其出色的耐热性、耐磨性、耐化学性、抗紫外线性和耐刮擦性而广泛应用于海上管道和汽车零部件。然而,我国的尼龙12行业面临着聚合单体化学合成技术壁垒高、合成路线长及生产成本高等问题,几乎全部依赖进口。虽然国外已经有了一些尼龙12单体生物合成的相关研究,但是效率均较低,且均为以月桂酸（DDA）及其衍生物为原料的生物转化,目前还没有实现以葡萄糖为原料的从头生物合成。为了实现尼龙12单体ω-氨基月桂酸（ω-AmDDA）的高效生物合成,本文以大肠杆菌为操作平台,从合成途径中关键酶的挖掘、平衡表达、分子改造、辅因子工程和耐受性工程等方面出发,开展了一系列代谢工程、酶工程和合成生物学方面的应用基础研究。为构建以DDA为底物高效合成ω-AmDDA的大肠杆菌工程菌株,首先对催化DDA末端羟基化、氧化和胺化步骤的酶进行了筛选。将筛选获得的脂肪酸末端羟基化P450酶嵌合体CYP153A-NCP、醇脱氢酶BsADHC257L、ω-转氨酶（ω-TA）CV2025在体外组装成两个催化模块M1和M2,并分别置于不同拷贝数的四种兼容质粒上,通过调整两个模块间以及模块内酶的表达强度,最终在大肠杆菌BL21（DE3）中成功构建催化DDA合成ω-AmDDA的多酶级联途径。随后,为满足全细胞催化合成ω-AmDDA过程对多种辅因子的需求,通过在多酶级联体系中引入还原力辅因子再生酶GDH1、转氨反应辅底物L-丙氨酸（L-Ala）再生酶AlaDH2和转氨酶辅因子磷酸吡哆醛（PLP）补充途径yaaDE,在异源级联途径与宿主天然代谢途径之间建立联系,成功促进了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH/NAD+）、PLP和L-Ala的胞内原位再生。同时,对宿主进行代谢改造,增强了疏水底物DDA的跨膜转运,并阻断了 DDA的β-氧化。最终获得的全细胞生物催化剂P1-1（E-M1-3/C-M2-2）催化5.0 mM DDA合成ω-AmDDA的产率达到96.5%。随后,通过引入饱和C12酰基-ACP特异性硫酯酶BTE,连接大肠杆菌的中心代谢途径和催化DDA合成ω-AmDDA的异源多酶级联催化途径,构建了以廉价可再生碳源葡萄糖（D-Glu）为原料的ω-AmDDA从头生物合成途径。为了提高ω-AmDDA的从头合成产量,对底盘细胞自身代谢网络、醇脱氢酶、质粒模块抗性筛选元件和摇瓶发酵反应条件分别进行了改造和优化。结果表明,在30℃、pH7.5条件下,添加2%的葡萄糖作为碳源、2g/LNH4HCO3为氮源,并以0.1 mM IPTG为诱导剂,使得从头合成ω-AmDDA产量达到27.5 mg/L。利用PLP合成强化宿主为底盘,并将醇脱氢酶更换为AlkJ,将抗性筛选标记更换为不易分解的氨基糖苷类抗生素,使从头合成ω-AmDDA产量得到进一步提升,达到80.9mg/L。最后,通过将与DDA合成相关的乙酰-CoA供应途径、乙酰-CoA活化途径和脂肪酸合成FAS Ⅱ途径及DDA衍生化所需的异源级联途径进行途径模块化调控,促进了 DDA合成及转化,所构建的菌株P1D5（EApr-M1-B3/C-M2-A）在摇瓶发酵中从头合成ω-AmDDA产量达到243 mg/L。最后,通过对从头合成途径限速步骤D D A羟基化反应的通量（核心途径层）、氧化还原及代谢能稳态（辅因子层）和氧化应激防御网络（胞内环境层）的多层次调整,提高了ω-AmDDA在大肠杆菌中的从头合成效率。利用理性及半理性设计手段提高了途径关键酶CYP153A-NCP的催化活性并增强了 DDA羟基化这个限速反应的通量。通过敲除非必要代谢途径的AT P消耗酶F e c E优化了细胞工厂的代谢能稳态,同时通过过表达还原力供应与分配相关的葡萄糖非磷酸化转运蛋白Glf和转氢酶PntAB重建了细胞工厂的氧化还原稳态。随后,通过活性氧（RO S）响应型转录因子OxyR的过表达对胞内氧化应激防御网络进行了调整优化,提高了细胞工厂对氧化应激胁迫的耐受性。最终获得的PDANR（EApr-M1-B3mut/C-M2-A）可利用葡萄糖为原料,在摇瓶培养中从头合成471 mg/L的ω-AmDDA。本项工作首次实现了ω-AmDDA的从头生物合成,为微生物发酵法生产尼龙12奠定了初步的基础。同时,在研究过程中开发的多酶级联催化、辅因子工程、耐受性工程和蛋白质工程策略为大肠杆菌合成其他脂肪酸衍生类化合物提供了参考思路。