论文部分内容阅读
目的 探讨人脐带间充质干细胞条件培养基(human umbilical cord mesenchymal stem cells conditioned medium,h UC-MSCs-CM)和N-乙酰半胱氨酸(Nacetylcysteine,NAC)对辐射相关氧化应激和海马神经元增殖及凋亡的影响。方法 用不同剂量(0、5、10、15Gy)的X射线分别辐射HT-22细胞,筛选最佳辐射剂量。应用酶消化法提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs),经培养、传代后于显微镜下观察形态,流式细胞仪检测细胞表面标志,选取处于指数生长期的第3代细胞,用无血清培养基培养48h,收集上清用于后续实验。实验分组:空白对照组(Control),单纯辐射组(RT),辐射+MSCs-CM组(RT+MSCs-CM),单纯MSCs-CM组(MSCsCM),辐射+NAC组(RT+NAC),辐射+MSCs-CM+PI3K抑制剂组(LY294002)。除Control组和MSCs-CM组外,其余各组均给予10Gy X线进行辐射。辐射24h后于倒置显微镜下观察HT-22细胞密度及形态;CCK-8法检测各处理组细胞增殖活力;流式细胞术Annexin-FITC/PI双标记检测各实验组细胞凋亡情况;二氯荧光素双乙酸酯(Dichlorofluorescin diacetate,DCFDA)荧光探针染色检测不同实验组细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)评估细胞内氧化应激水平;比色法测定细胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;JC-1荧光探针检测各实验组细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP);Western blot检测不同实验组细胞内γ-H2AX、p-PI3K、pAKT、P53、Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果 1 HT-22细胞分别经0、5、10、15Gy剂量辐射暴露后,细胞增殖活力呈剂量依赖性降低,细胞凋亡率与辐射剂量成正比,各剂量辐射组与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。2在倒置相差显微镜下观察第3代h UC-MSCs的细胞形态呈梭形、漩涡状排列。3流式细胞仪检测符合h UC-MSCs的表型特征。4与RT组相比,RT+MSCs-CM组及RT+NAC组HT-22细胞增殖率明显增高(P<0.01);细胞内MMP、ROS、MDA水平降低;GSH含量及SOD活性增加(P<0.01)。5 MSCs-CM和NAC均可减少辐射后神经元细胞内γ-H2AX的含量;减少促凋亡蛋白P53、Bax、Cleaved-caspase-3的表达(P<0.01),增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。6 Western blot结果显示,与Control组相比,RT+MSCs-CM组和MSCs-CM组HT-22细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白的水平明显增加;PI3K抑制剂(LY294002)能拮抗MSCs-CM对HT-22细胞内p-PI3K的上调作用,并下调pAKT蛋白的表达。而NAC对PI3K-AKT信号通路无无明显调节作用。结论 1 h UC-MSCs-CM和NAC均可改善辐射暴露后HT-22细胞的增殖抑制,减少细胞凋亡。2 h UC-MSCs-CM和NAC对辐射暴露后HT-22细胞的保护机制包括减轻辐射后细胞内氧化应激、减少DNA双链断裂,上调线粒体膜电位。3 h UCMSCs-CM可通过激活PI3K-AKT信号通路发挥神经元保护作用,从而减少辐射诱导的神经元细胞的凋亡。4辐射暴露后h UC-MSCs-CM对HT-22细胞的保护作用优于NAC。图13幅;表17个;参147篇。