三肽囊素（赖氨酰-组氨酰-甘氨酰胺，KHG-NH₂，Bursin）是一种从鸡法氏囊中纯化到的三肽物质，具有诱导B淋巴细胞的分化、提高机体抗体水平、促进T淋巴细胞转化活性、抑制细胞凋亡等作用。基于三肽囊素对畜禽的免疫增强作用，大量的研究集中于将其作为一种免疫增强剂应用于畜禽生产，由于从禽法氏囊提取的数量有限、化学合成成本高等原因，难以在畜禽生产中广泛应用。本研究诣在研制高亲和力三肽囊素单克隆抗体基础上，从噬菌体随机肽库中筛选具有免疫增强活性的三肽囊素模拟表位，以期作为三肽囊素免疫增强活性的功能替代品在畜禽生产中的应用打下基础。1.三肽囊素人工抗原的制备三肽囊素分子上有多个氨基可用于与载体蛋白偶联，载体蛋白与不同位置氨基偶联制备的人工抗原免疫小鼠均可能获得抗三肽囊素抗体，虽然大部分抗体适合用于建立三肽囊素的免疫学检测方法，但以不同单抗为配体筛选的噬菌体模拟表位的生物学特性可能存在较大差异。（1）分别采用EDC法和SMCC法将三肽囊素分子赖氨酰（K）上的氨基分别与载体蛋白（BSA、OVA）的羧基发生定向偶联制备人工抗原BSA-KHG-NH₂、OVA-KHG-NH₂和BSA-S-KHG-NH₂；以BSA-KHG-NH₂免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠抗体效价高达1:102400；免疫鼠血清多克隆抗体与OVA-KHG-NH₂的结合能被Bursin、GKHG-NH₂标品特异性阻断，但不能被KHGK标品阻断，表明免疫小鼠产生了抗三肽囊素特异性抗体。以免疫小鼠血清建立的间接竞争ELISA标准曲线的检测线性范围在15～1000ng/mL之间，50%竞争抑制的三肽囊素浓度（IC50）为292ng/mL。（2）采用EDC法将三肽囊素分子甘氨酰胺（G）上的氨基分别与载体蛋白（BSA、OVA）定向偶联制备人工抗原，以KHG-NH-BSA免疫BALB/c小鼠。虽然免疫小鼠产生了较高的抗体效价，但是小鼠血清多抗与KHG-NH-OVA或KHG-NH-8MAP的结合不能被能被三肽囊素（KHG-NH₂）特异性阻断，由此推测免疫小鼠未产生高滴度的抗三肽囊素特异性抗体。2.抗三肽囊素单克隆抗体的研制（1）以三肽囊素人工抗原BSA-KHG-NH₂免疫5只BALB/c小鼠，共进行4次细胞融合，筛选到18株能稳定分泌抗三肽囊素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为4A11、7B2、2D2、2A6、3E10、5D8、5F2、5F8、6D4、8C11、11C4、11E9、12A5、12G10、14A9、15C10、15H5、17B2。筛选的18株单抗与三肽囊素分子的结合具有方向性，三肽囊素分子的甘氨酰胺（Gly）上的氨基与其他氨基酸连接后就不能与单抗结合；单抗与三肽囊素分子的结合存在较大差异，三肽囊素阻断的IC50为20.3～122.3ng/mL；18株单抗与GKHG-NH₂的交叉反应率为22.8～387.6%，与KHGK交叉反应率均小于4.3%；亲和常数为3.95×10⁶～2.39×10⁷；单肮腹水效价为1.28×10⁵～5.12×10⁵。从18株单抗中优选到2株（2D2、11C4）适合用于三肽囊素模拟表淘选。基于单抗2D2建立的三肽囊素间接竞争ELISA检测的线性范围为7.8～250ng/mL，50%竞争抑制浓度（IC50）为25.6ng/mL，回归方程为Y=116.07-19.79×Ln（x），R²=0.9971。以本试验建立的ELISA方法对6个法氏囊样品中三肽囊素含量进行了检测，结果分别为50.59、78.53、89.25、47.7、92.54和94.39ng/g法氏囊组织。（2）以免疫抗原KHG-NH-BSA免疫5只BALB/c小鼠，进行了2次细胞融合，但未筛选到分泌抗三肽囊素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。3．噬菌体七肽模拟表位的筛选及其生物活性的研究以单克隆抗体2D2为配体，从噬菌体随机七肽库中淘选三肽囊素模拟表位，通过4轮淘选，筛选到27个含三肽囊素模拟表位的噬菌体阳性克隆。通过对阳性噬菌体克隆特异性分析，优选“NO.40”与单抗2D2亲和性最高（IC50=60.1ng/mL），用于进行免疫增强活性研究。将不同浓度的Bursin标品、GKHG-NH₂四肽、KHGK四肽、KHG三肽以及5个IC50值不同的噬菌体克隆分别加入到杂交瘤细胞2C6株（抗猪痘病毒P35蛋白单抗）培养液中，培养48h后检测其细胞液中抗P35蛋白抗体效价，并根据建立的P35单克隆抗体2C6建立标准曲线计算每孔抗体蛋白含量。结果表明Bursin标品浓度为5μg/mL时，抗体分泌增加了35.4%，其它三肽囊素类似肽对抗体分泌增强作用不明显；“NO.40”噬菌体(1.5×10¹⁶pfu/mL)使抗体分泌增加26.6%，其它噬菌体对抗体分泌增强作用不明显。三肽囊素噬菌体七肽模拟表位的免疫增强生物学活性结果初步证明：三肽囊素模拟表位具有与三肽囊素类似的免疫增强活性，有望成为三肽囊素免疫增强活性的功能替代品。