【摘 要】
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第一部分中性粒细胞哮喘小鼠模型经尾静脉及滴鼻途径sRAGE基因转染小鼠的有效性比较目的:探讨尾静脉注射及滴鼻两种途径转染腺相关病毒（AAV）可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）至中性粒细胞哮喘小鼠,通过检测其肺组织中sRAGE的表达水平,比较两种途径的有效性。方法:1.中性粒细胞哮喘小鼠模型的建立:选取16只C57BL/6雌性小鼠,随机分为中性粒细胞性哮喘组（NA组）、空白对照组（NC组）,
【基金项目】
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项目名称:sRAGE 调控儿童中性粒细胞哮喘气道重塑机制研究，项目合同编号:2018GXNSFAA281256，项目来源:广西科技厅，项目起止时间:2019.1-2021.12
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第一部分中性粒细胞哮喘小鼠模型经尾静脉及滴鼻途径sRAGE基因转染小鼠的有效性比较目的:探讨尾静脉注射及滴鼻两种途径转染腺相关病毒（AAV）可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）至中性粒细胞哮喘小鼠,通过检测其肺组织中sRAGE的表达水平,比较两种途径的有效性。方法:1.中性粒细胞哮喘小鼠模型的建立:选取16只C57BL/6雌性小鼠,随机分为中性粒细胞性哮喘组（NA组）、空白对照组（NC组）,每组各8只,常规饲养。实验第1天、7天和14天给予100 ug OVA（GradeⅤ）及1ug脂多糖（LPS）各致敏1次,共3次,从鼻咽部滴入气道致敏。小鼠激发:从实验第21天起,予用1%卵清白蛋白（OVA）（GradeⅡ）溶液进行雾化吸入激发,每天雾化1小时,连续雾化7天,观察并记录小鼠哮喘发作情况。NC组用相同剂量的磷酸盐缓冲液（PBS）进行致敏和激发。通过观察雾化时小鼠的症状,检测小鼠肺功能、光镜下观察肺病理改变、肺泡灌洗液（BALF）计数中性粒细胞百分比例等,评价NA模型是否成功建立。2.尾静脉及滴鼻腺相关病毒介导sRAGE转染小鼠的有效性比较:选取32只健康的C57BL/6雌性小鼠,随机分为4组NA组、sRAGE尾静脉注射组、sRAGE滴鼻组、NC组,每组各8只,按常规饲养。实验第1天sRAGE尾静脉注射组通过尾静脉注射AAV 9-sRAGE 100ul进行转染;sRAGE滴鼻组通过滴鼻方式滴注AAV9-sRAGE 100ul;实验第7天开始按照NA的造模方法,对NA组、sRAGE尾静脉注射组、sRAGE滴鼻组进行干预,NC组以等量PBS致敏和激发。通过检测BALF中sRAGE的水平、肺冰冻切片观察绿色荧光蛋白检测sRAGE的表达进行比较两种方法的有效性。结果:1.与NC组相比,NA组小鼠频繁出现打喷嚏、呼吸急促、搔抓头面部等激发症状,在12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml浓度乙酰甲胆碱激发后NA组气道阻力高于NC组,有统计学差异,（P0.05）。结论:腺相关病毒通过尾静脉注射和滴鼻两种途径均能有效转染NA小鼠。第二部分腺相关病毒介导sRAGE转染中性粒细胞哮喘小鼠气道炎症的影响目的:初步探讨sRAGE对中性粒细胞哮喘小鼠气道炎症的抑制作用。方法:选取32只健康的C57BL/6雌性小鼠,随机分为NA组、NA+sRAGE组、NA+sRAGE阴性对照组、NC组,每组各8只,按常规饲养。实验第1天NA+sRAGE组通过尾静脉注射AAV9-sRAGE 100ul进行转染;NA+sRAGE阴性对照组通过尾静脉注射AAV9-CON 336 100ul;NA组和NC组尾静脉注射等量PBS。实验第7天开始按照NA的造模方法对NA组、NA+sRAGE组、NA+sRAGE阴性对照组进行干预,NC组以等量PBS致敏和激发。雾化期间观察各组小鼠出现的症状并记录。雾化结束后,测定各组小鼠肺功能指标,记录分析,取小鼠肺进行病理学检查,作HE染色、松三色染色（Masson染色）、过碘酸雪夫染色（PAS染色）,观察各组镜下的病理变化,并进行半定量评分。取BALF进行细胞分类计数及ELISA检测BALF中sRAGE、IL-17等炎症因子的变化。结果:1.NA组及NA+sRAGE阴性对照组小鼠在雾化时出现明显的激发症状。NC组小鼠无明显症状,NA+sRAGE组可出现类似表现,但程度及频率均较低。2.12.5 mg/ml和25mg/ml的乙酰甲胆碱的激发后,NA组及NA+sRAGE阴性对照组气道阻力均高于NC组和NA+sRAGE组（P<0.05）;50mg/m L乙酰胆碱雾化激发后,NA组及NA+sRAGE阴性对照组气道阻力高于NC组（P0.05）。3.与NA组及NA+sRAGE阴性对照组相比,NA+sRAGE组中的BALF细胞总数及中性粒细胞比例明显减少,（P<0.0001）;4.与NA组及NA+sRAGE阴性对照组相比,NA+sRAGE组小鼠肺病理炎细胞浸润明显改善,胶原沉积减少,杯状细胞的黏液分泌减少;5.NA组及NA+sRAGE阴性对照组BALF中sRAGE水平低于NC组与NA+sRAGE组（P<0.05）;NA组及NA+sRAGE阴性对照组BALF中IL-17水平高于NC组与NA+sRAGE组（P<0.05）;6.BALF中sRAGE水平与IL-17呈负相关（R=-0.526,P<0.014）,BALF中sRAGE水平与中性粒细胞比例呈负相关（R=-0.80,P<0.0001）,BALF中IL-17水平与中性粒细胞比例呈正相关（R=0.480,P<0.018）。结论:1.NA小鼠BALF中sRAGE表达水平下降,与IL-17水平和中性粒细胞百分比例成负相关。2.腺相关病毒过表达sRAGE干预NA小鼠中可改善气道中性粒细胞炎症。
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