目的:
　　观察不同浓度催乳素对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、蛋白分泌及相关蛋白基因表达功能的影响。
　　方法:
　　无菌取出新生奶牛的肋骨,采用组织块培养法获取成骨细胞,进行原代、传代培养,取第二代细胞通过形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙化结节染色等方法鉴定后作为试验模型,将用含20％胎牛血清的DMEM培养液配制的不同浓度的催乳素(0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL)与第二代奶牛的成骨细胞共同培养。采用MTT法观察催乳素对成骨细胞增殖功能的影响(用波长570nm处OD值表示);氨基安替吡啉测酚法(金氏法)观察对成骨细胞分化功能的影响(用碱性磷酸酶活性表示);放射免疫法观察对成骨细胞分泌骨钙素和肿瘤坏死因子-α的影响(用放免活性单位—ng/mL表示);RT-PCR法观察对成骨细胞骨钙素mRNA和肿瘤坏死因子-αmRNA表达影响。
　　结果:
　　采用组织块培养法获得的细胞具有典型成骨细胞的形态特征,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性且阳性率达90％以上,钙化结节经茜素红染色呈阳性,符合成骨细胞的生物学特性,表明培养的细胞为高纯度的成骨细胞。加催乳素培养后测定细胞的增殖结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞的增殖作用。0.1、1.0、10.0μg/mL试验组与对照组比较差异不显著(P>0.05),0.01μg╱mL试验组与对照组比较差异极显著(P<0.01),各浓度催乳素抑制奶牛成骨细胞的增殖作用不存在时间-效应关系。加催乳素培养后测定碱性磷酸酶(ALP)活性结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞碱性磷酸酶的分泌。与对照组相比,0.1、1.0、10.01μg/mL试验组均可抑制碱性磷酸酶的分泌,但与对照组比较差异不显著(P>0.05),0.01μg/mL试验组与对照组比较差异极显著(P<0.01)。加入不同浓度催乳素培养7d后,0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组表现为抑制骨钙素的分泌,与对照组比较差异不显著(P>0.05);0.01μg╱mL试验组则表现为促进骨钙素的分泌,与对照组比较差异极显著(P<0.01)。
　　加入不同浓度催乳素培养7d后,较对照组,肿瘤坏死因子-α的分泌均呈不同程度增多,其中1.0μg╱mL和10.0μg╱mL试验组与对照组比较差异显著(P<0.05),0.01μg╱mL和0.1μg╱mL试验组与对照组比较差异极显著(P<0.01)。催乳素作用10d后提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测BGP mRNA和TNF-αmRNA表达情况,试验结果显示:0.1、1.0、10.0μg/mL试验组较对照组BGP mRNA表达量均降低,0.01μg╱mL试验组较对照组BGP mRNA表达量升高;0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组较对照组TNF-αmRNA表达量均升高。
　　结论:
　　在一定浓度范围内(0.01μg╱mL~10.0μg╱mL),催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的增殖。在一定浓度范围内(0.01μg╱mL~10.0μg╱mL),催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的分化。在一定的浓度范围内(0.01μg╱mL~10.0μg╱mL),低浓度催乳素促进成骨细胞BGP蛋白的分泌,而高浓度催乳素则抑制成骨细胞BGP蛋白的分泌。在一定浓度范围内(0.01μg╱mL~10.0μg╱mL),催乳素使成骨细胞TNF-α蛋白的分泌均呈不同程度增多。一定的浓度范围内(0.01μg╱mL~10.0μg╱mL),催乳素对成骨细胞BGP和TNF-αmRNA表达的影响趋势,同催乳素干预成骨细胞分泌相关蛋白的趋势一致。