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目的研究硒对于氧化损伤肝细胞糖代谢关键酶表达的影响,为进一步研究硒改善糖尿病糖代谢紊乱的分子机制提供实验依据。方法1.氧化损伤细胞模型的建立及鉴定:采用不同浓度的H2O2（0.05、0.1、0.2、0.5、1mmol/L）诱导正常大鼠肝细胞（BRL）建立了氧化损伤的细胞模型,并通过细胞形态学观察、MTT实验和抗氧化指标检测进行模型鉴定。2.硒对细胞氧化损伤的保护作用研究:细胞分为5组,正常对照组、损伤模型组（H2O2浓度为0.1 mmol/L）、损伤+低剂量补硒组（Se-L组）、损伤+中剂量补硒组（Se-M组）、损伤+高剂量补硒组（Se-H组）,其中Na2SeO3终浓度分别为0.05、0.1和1μmol/L。通过测定细胞活力测定、抗氧化指标和细胞凋亡率研究硒对氧化损伤细胞的保护作用,并通过实时定量PCR技术检测细胞GSH-Px的mRNA的表达水平探讨其作用机制。3.硒对于氧化损伤肝细胞糖代谢酶的影响:细胞分组同前,采用实时定量PCR技术测定细胞糖代谢、胰岛素信号通路和细胞凋亡通路中关键蛋白葡萄糖激酶（glucokinase,GK）、糖原合成酶（glycogen synthase,GS）、蛋白激酶B（proteinkinase B,PKB/Akt）和凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1）的mRNA表达情况;采用酶联免疫法（ELISA）检测细胞中GK、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）蛋白表达水平;并通过Western blot检测胰岛素和细胞凋亡信号通路蛋白Akt和ASK1的表达情况。结果1.体外BRL氧化损伤模型的建立:形态学观察结果显示,与正常对照组相比,0.05～0.2mmol/L H2O2损伤组细胞变形,但细胞边界尚清楚,0.5和1mmol/LH2O2损伤组细胞明显变形,胞膜边缘不清晰,有较多细胞脱落。H2O2氧化损伤组细胞活力MTT（OD）降低,与正常对照组相比,差别有统计学意义（P＜0.05）,并且随着H2O2浓度升高,MTT有降低趋势。氧化损伤组细胞谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性降低,丙二醛（maleic dialdehyde,MDA）含量升高,与正常对照组相比,差别有统计学意义（P＜0.05）。2.补硒对体外氧化损伤肝细胞的保护作用:倒置相差显微镜观察,损伤组细胞变形,细胞间隙增大,Se-L组与损伤组相比,细胞形态稍有改善,细胞间隙缩小,细胞间连接增加;Se-M和Se-H组与损伤组相比,细胞间隙明显缩小,形态基本恢复正常。补硒组细胞MTT（OD）值、GSH-Px和SOD活性高于H2O2损伤模型组,MDA含量和细胞凋亡率低于损伤模型组,差别有统计学意义（P＜0.05）。补硒组细胞GSH-Px的mRNA表达水平高于损伤模型组,差别有统计学意义（P＜0.05）。3.硒对于氧化损伤肝细胞糖代谢酶的影响:损伤模型组细胞GK的mRNA和蛋白表达水平低于正常对照组,差别有统计学意义（P＜0.05）,补硒组GK的mRNA和蛋白表达水平高于损伤组,差别有统计学意义（P＜0.05）。损伤模型组细胞Akt的mRNA和蛋白表达水平低于正常对照组,差别有统计学意义（P＜0.05）,补硒组Akt的mRNA和蛋白表达水平高于损伤组,差别有统计学意义（P＜0.05）。损伤模型组GSK-3蛋白表达水平低于正常对照组,差别有统计学意义（P＜0.05）,补硒组GSK-3蛋白表达水平与损伤组相比,差别无统计学意义（P＞0.05）。损伤模型组GS的mRNA表达水平低于正常对照组,差别有统计学意义（P＜0.05）,补硒组细胞GS的mRNA表达水平高于损伤组差别有统计学意义（P＜0.05）。损伤模型组细胞ASK1的mRNA和蛋白表达水平高于正常对照组,差别有统计学意义（P＜0.05）,补硒组细胞ASK1的mRNA和蛋白表达水平低于损伤模型组,差别有统计学意义（P＜0.05）。结论1.本研究采用不同浓度的H2O2诱导正常大鼠肝细胞（BRL）建立了氧化损伤的细胞模型,并通过细胞形态学观察、MTT实验和抗氧化指标的检测进行模型鉴定,确定了0.1mmol/L的H2O2为适合实验研究的损伤浓度。2.观察不同浓度的硒对氧化损伤的肝细胞模型的糖代谢关键酶GK、GS、GSK-3的影响。结果显示,硒可以上调氧化损伤肝细胞GK的mRNA和蛋白表达水平,同时可以上调GS mRNA的表达水平,提示硒可以在一定程度上改善氧化损伤对肝细胞糖代谢关键酶的影响。其可能的机制如下:1.抗氧化途径:硒通过提高氧化损伤肝细胞的SOD活力、增加细胞GSH-Px的mRNA表达水平和酶活性、降低细胞中MDA含量等作用,对氧化损伤的肝细胞起到一定的保护作用。2.PI3K-Akt-GSK3途径:硒通过提高胰岛素信号传导通路（PI3K-Akt-GSK3）中关键信号分子Akt的mRNA和蛋白表达的水平,进而促进了胰岛素的信号传导。3.细胞凋亡信号传导途径:硒通过抑制ASK1的mRNA和蛋白表达的水平,降低细胞凋亡率,抑制氧化损伤所致的细胞凋亡,进而改善氧化损伤对肝细胞糖代谢酶的影响。