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神经细胞是一类高度极化的细胞,由接收信号的树突、胞体和传输信号的轴突组成,不同的物质组成构成了树突、胞体、轴突不同的形态和各自独特的生理功能。神经细胞轴突起始段(AIS)是神经细胞轴突近端靠近胞体的特定膜结构区域,富集了大量的电压门控钠离子通道(Nav channe1)、电压门控钾离子通道(KCNQ2/3)、细胞粘附分子(Nfasc、NrCAM等)及多种支架蛋白和细胞骨架蛋白,是神经细胞整合胞体和树突的输入信号,调控和产生动作电位的重要位点。Ankyrin-G作为一类支架蛋白特异性定位在AIS,被称为AIS的标志物。它能将多种离子通道,细胞粘附分子等锚定在细胞膜上,从而保持AIS的完整与稳定。轴突起始段特殊的定位使其也起到特异性分子筛的作用,通过选择性的调控进入轴突的蛋白和特定细胞器,从而维持神经细胞轴突-树突的极性,然而这一选择性调控物质进出轴突的分子机制还不是很清楚。同时,GABAA受体在轴突起始段也有大量分布,轴突起始段是神经细胞产生动作电位的源头,GABAA受体作为一个抑制性的神经递质受体定位轴突起始段,提供抑制性信号来调节动作电位的产生,对神经信号的产生传递具有重要作用。已有研究表明,Ankyrin-G对轴突起始段GABAA受体的稳定具有重要的调节作用,但是具体的作用机理还不明确。神经极性的破坏和神经信号传递的功能失调与多种人类神经系统疾病的发生密切相关。因此,研究Ankyrin-G及其介导的蛋白复合物在神经细胞极性维持和神经信号传递过程中的功能机制具有重要的科学意义。Ndel1是细胞内重要分子马达Dynein复合物的调控蛋白。此前研究表明Ndel1在神经细胞发育分化的早期经历了一个从胞体内中心粒周围转移到轴突起始段的重定位过程。在本论文中,我们通过体外生化实验确定了 Ndel的轴突起始段定位依赖于与Ankyrin-G的直接结合,并利用等温滴定量热实验(ITC)确定了两个蛋白能够结合的最小区域。我们进一步发现Ankyrin-G结合Ndel1的比例为1:2,同Ndel1在体内以二聚体来行使功能的现象相吻合。随后我们发现Ankyrin-G的同源蛋白Ankyrin-B以相似的性质结合Ndel 1,并解析了 Ankyrin-B/Ndel1复合物的三维结构,确定了 Ankyrin-G和Ankyrin-B结合Ndel1的分子机理主要是通过六个不同层面的疏水相互作用所介导。在小鼠海马神经元中特异性敲除Ankyrin-G之后,Ndel1也失去了 AIS的特异性定位回补野生型Ankyrin-G后,Ndel1又重新定位到AIS,提示Ndel1特异性定位到AIS依赖于其与Ankyrin-G的相互作用。我们根据生化及结构信息设计了一段Ankyrin-G来源的特异性结合Ndel1的短肽,将此短肽转入小鼠海马神经元中后,发现其在胞体聚集,并将原本定位在AIS的Ndel1全都拉回到胞体,并且转入此短肽后,原本特异性定位在胞体和树突的蛋白(如TfR,GluR1和CAR)则能通过AIS进入到轴突。这一发现揭示了 Ankyrin-G/Ndel1复合物在神经轴突起始段做为一个特异性分子筛能选择性的阻止原本不属于轴突的货物进入轴突,从而维持神经细胞的极性,并提示Ndel1/Ankyrin-B复合物可能调控货物在远端轴突的运输。此前有研究表明,GABARAP通过直接结合GABAA受体的γ2亚基来稳定细胞膜表面的GABAA受体,而Ankyrin-G又能直接结合GABARAP,这提示我们Ankyrin-G可能通过GABARAP来稳定细胞膜表面的GABAA受体。在此研究中,我们通过生化试验发现GABARAP能直接结合GABAA受体的γ2亚基的胞内loop上一段18个氨基酸的序列,随后解析的GABAA受体γ2/GABARAPL1复合物晶体结构表明GABARAP特异性识别LIR motif是介导GABAA受体γ2亚基与GABARAP之间相互作用的主要原因,而GABARAP也是以同样的方式结合Ankyrin-G,这说明GABAA受体γ2亚基和Ankyrin-G不可能同时结合GABARAP。我们通过在HEK-293细胞中过表达GABAA受体和GABARAP并通过电生理检测发现GABARAP能明显促进GABAA受体向细胞膜转运。最后我们通过病毒载体过表达Ankyrin-G上超强并特异性结合GABARAP的短肽打破小鼠体内GABAA受体/GABARAP之间的结合,发现小鼠锥体神经元的抑制性突触后电位的振幅明显降低,这表明打破GABARAP与GABAA受体结合的确会影响GABA能神经元信号传递,其原因很大可能是降低了 GABAA受体向细胞膜上的转运,这也提示我们Ankyrin-G在细胞膜下通过竞争性结合GABARAP来释放GABAA受体,从而维持细胞膜上GABAA受体的动态平衡。综上所述,我们通过多种生物学方法,围绕Ankyrin-G介导的蛋白复合物在神经细胞轴突起始段处的具体功能展开细致研究,从原子水平上揭示了 Ankyrin-G/Ndel1 复合物和 GABAA 受体/GABARAPL1 复合物的分子作用机制,为进 一步理解神经细胞极性维持和神经信号传递奠定了结构和功能基础,也为相关神经系统疾病的发病机制和治疗提供了新的研究策略和分子靶点。