研究背景与目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,肝癌影响患者预后的主要因素是其高复发及转移特性。目前用于治疗肝癌的方案主要有手术切除和肝脏移植,但经过手术切除后的患者往往面临着高复发风险。目前有研究表明,包括手术操作在内的应激可促进肿瘤细胞的生长和侵袭,围术期是患者术后肿瘤复发和长期预后的影响因素之一。因此,在肝脏肿瘤手术期使用的具有抑制肝癌细胞生长和侵袭性的麻醉药物或方法,理论上可降低肝癌细胞扩散风险。异丙酚(propofol)是一种全身麻醉剂,目前该药已广泛应用于临床麻醉及镇静,其特点是起效快,持续时间短,苏醒迅速而平稳,不良反应少。近年有研究报道了异丙酚对人肝癌细胞HepG2的生长和侵袭能力具有较强的抑制作用,但具体的分子机制仍未清晰。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮表型细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,它使细胞具有更强的转移和侵入能力,具体机制可能涉及干细胞特性、减少细胞凋亡和促进免疫抑制。现阶段学术界认为EMT是导致肝癌复发和转移的关键因素,而Wnt通路恰恰是诱发EMT的一个关键因素。Wnt信号通路通过抑制细胞质中β-连锁蛋白(β-catenin)的降解从而引起其在细胞内积累。β-catenin是具有多种功能的蛋白质,它能在细胞连接处与钙粘素相互作用,参与形成粘合带,而游离的β-catenin可进入细胞核与TCF/LEF家族转录因子相互作用,调节特定基因表达。Wnt信号在动物发育中起重要作用,一般在正常生理条件下,Wnt通路的激活受到严格的监控。然而大量研究证据表明Wnt通路在各种肿瘤中均持续激活,并与HCC的发生发展密切相关,近年文献显示异丙酚能一定程度上降低肝癌细胞β-catenin的mRNA表达,但对于异丙酚是否真正能通过抑制Wnt信号而产生抑瘤作用,目前仍未清晰。有鉴于此,本课题旨在研究异丙酚在Wnt/β-catenin信号通路中对人肝癌细胞侵袭转移能力及EMT发生的作用,为肝癌病人术中合理使用麻醉药物提供新的理论依据。方法1.用逐渐增量(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)的异丙酚刺激人肝癌细胞(HepG2、QGY-7703、SMMC-7721、HCCLM3)后,通过体外的细胞功能学实验(划痕实验、Transwell、三维培养实验)检测异丙酚对人肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。2.选取经确定浓度(20ug/ml)的异丙酚刺激人肝癌细胞HCCLM3,Western blot检测异丙酚刺激后HCCLM3细胞EMT相关maker(E-cadherin,Vimentin)的表达情况,免疫荧光实验检测E-cadherin和Vimentin的表达和定位。3.选取经确定浓度(20ug/ml)的异丙酚刺激人肝癌细胞HCCLM3,荧光素酶报告基因法(经典的Top flash/Fop flash)检测Tcf-4活性间接反映β-catenin的激活情况,Western blot检测β-catenin在核蛋白与浆蛋白中的表达情况,Real-time PCR检测细胞Wnt下游的经典靶基因(MYC、MMP9、TCF4)的mRNA表达水平。4.用终浓度20 mmol/L的Wnt通路激活剂(氯化锂)与异丙酚(20ug/ml)同时刺激HCCLM3细胞。与对照组(20ug/ml异丙酚)比较,荧光素酶报告基因法检测β-catenin的激活情况;划痕实验和Transwell侵袭实验检测肝癌细胞迁移和侵袭能力的变化。结果1.随着异丙酚浓度的提高,划痕实验显示异丙酚能抑制肝癌细胞的迁移能力增加,Transwell侵袭实验和三维培养实验则显示异丙酚能抑制肝癌细胞侵袭能力增强。2.异丙酚刺激HCCLM3细胞后,肝癌细胞的上皮间充质转化得到抑制,上皮标志物E-cadherin表达上调,而间质标志物Vimentin表达下调。3.异丙酚刺激HCCLM3细胞后,β-catenin荧光素酶活性降低、从而使得β-catenin蛋白在细胞核中的表达水平降低,同时Wnt信号通路的下游基因MYC、MMP9、TCF4的mRNA表达均下降。4.用Wnt通路激活剂(氯化锂)和异丙酚(20ug/ml)同时刺激HCCLM3细胞后,与对照组(异丙酚)相比较,其β-catenin荧光素酶活性增强,同时使得细胞的迁移和侵袭能力增强。结论1.异丙酚(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)均可抑制体外人肝癌细胞的迁移、侵袭,随着异丙酚浓度的提高而增强。2.异丙酚(20ug/ml)可抑制体外人肝癌细胞上皮间充质转化(EMT)的发生。3.异丙酚可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节肝癌细胞的迁移、侵袭。