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肿瘤生物治疗在肿瘤的综合治疗中起到很重要的作用,其中肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的热点之一,近年来发展迅速,且不同于传统概念上对疫苗的定义。肿瘤疫苗的主要目的是肿瘤的治疗,而不是用于预防。肿瘤疫苗最大的优势是通过诱发机体全身性抗肿瘤的主动特异性免疫并形成免疫记忆,监测肿瘤的复发,产生有效而持久的抗肿瘤作用,从而有效地治疗肿瘤,并预防复发和转移。新肿瘤疫苗治疗靶点的寻找、肿瘤疫苗治疗的靶向性以及新型佐剂的应用将成为研究肿瘤疫苗的重点。目的本研究的主要目的是筛选和鉴定在肿瘤细胞中高表达的癌睾抗原PL2L60的HLA-A2限制性CTL表位以及对候选的优势表位进行改造,引入一种新的Tyr类似物的改造,这种改造能增强表位的结合力,稳定性以及免疫原性。方法首先,通过使用生物信息学的预测工具NetCTL1.2, BIMAS, SYFPEITHI和IEDB对PL2L60的HLA-A2限制性表位进行预测。得到高分值的野生型九肽,进行初步的筛选和鉴定确定合适的候选肽,随后对候选肽进行1位Tyr以及Tyr类似物的替换。候选表位肽采用标准Fmoc方案进行合成,经RP-HPLC纯化后,质谱分析证实其分子量应符合理论值。通过T2细胞结合力和稳定性实验来检测表位肽与MHC分子的亲和力和稳定性,RT-PCR和Western blot用来分析肿瘤细胞系中PL2L60的表达,胞内因子染色、ELISPOT实验和体内的细胞毒活性实验等检测表位肽诱导CTL的能力,通过酶降解稳定性分析来比较野生型原肽和改造肽在人血清中的降解速率。结果1.基于四个预测程序的结果,我们选择了以下九个天然表位肽：P42（MLLKGEIL）, P49（LLLPELSFM）, P56（FMTGIPEKM）, P274（ILLQINCKL）, P281（KLGGELWGV）, P317（FVASINLTL）, P400（YQPKMVVFV）, P418（YLAAPQNFV）, P522（QLCENLFFL）。随后进行标准的Fmoc固相合成,质谱鉴定符合理论分子量。2.野生型表位P281显示出了较强的亲和力（FI值为2.42）,而且P281的DCso大于4小时,所以选定P281作为母体肽进行改造。8条改造肽中,均表现了较强的亲和力（FI>1）。3.P281以及相关改造肽的体内外实验。①ELISPOT和胞内因子染色实验检测P281以及相关改造肽体外诱导特异性CTL的能力,其中P2811y、 P2811Nal、 P2811CF和P2811F能够在HLA-A2阳性供者的外周血单核细胞中诱导一定数量的特异性的CTL并能释放产生IFN-γ。②体内外细胞毒活性实验中,P2811CF和P2811F均能够诱导特异性CTL并杀伤靶细胞。③交叉反应实验表明P2811CF和P2811F体外诱导特异性CTL均能识别荷P281的T2细胞以及荷相应的改造肽的T2细胞。④P281以及相关改造肽的体内ELISPOT和ELISA实验结果表明P2811CF和P2811F也能在转基因小鼠体内诱导出一定数量的分泌IFN-γ的CTL细胞数。⑤将1y、1Nal、1CF和1F四种改造同样适用于P154、P271天然肽上,经1CF改造后的多肽,效果稳定。4.酶降解稳定性分析比较野生型原肽和改造肽在人血清中的降解速率。结果表明：P2811CF比其他肽更加稳定,在血清中显示出较好的稳定性。结论1.天然表位肽P281及其改造表位均显示出了较强的结合力和稳定性,其中部分改造肽的结合力和稳定性高于母体肽。2.用HLA-A2+健康供者外周血单核细胞,通过ELISPOT和胞内因子染色实验显示P2811CF能诱导一定数量的特异性的CTL并能释放产生IFN-γ;LDH以及CFSE细胞毒性实验显示P2811CF诱导的特异性CTL可以有效杀伤MCF-7（HLA-A2+, PL2L60+）肿瘤细胞,并且具有一定的HLA限制性。3.转基因小鼠体内实验结果显示P2811CF能够在体内能够被自然的加工和呈递,并且能够诱导特异性CTL反应。4.酶降解稳定性分析结果显示P2811CF比其它肽在血清中显示出较好的稳定性。5.将1y、1Nal、1CF和1F四种改造不仅仅适用与P281,也适用于其他表位,其中经1CF改造的天然肽能增强表位的免疫原性。6.综上所述,我们的结果显示天然表位肽P281可能是PL2L60抗原的HLA-A2限制性CTL候选表位:P2811CF能增强表位的结合力,稳定性以及免疫原性。