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一、研究背景前列腺癌是欧美国家最常见的男性恶性肿瘤之一，在男性癌症死因中排在第二位。我国前列腺癌发病率虽然远低于西方国家，但近年来随着人口老龄化及生活条件的改善，发病率增长显著。前列腺癌患者经一段时间内分泌治疗后几乎全部发生雄性激素非依赖性转化。目前，在临床上雄性激素非依赖性前列腺癌尚无有效的治疗方法，其发生的具体机制仍然不清楚。雄激素受体一直是前列腺癌雄性激素性非依赖转化机制研究的重点，但其不能解释所有雄激素非依赖转化的相关现象。雄激素受体不是前列腺癌发生雄激素非依赖转化的唯一的因素。有研究已经证实，前列腺癌LNCaP细胞经缺氧培养，细胞将呈神经内分泌改变。前列腺癌组织内神经内分泌（NE）细胞的存在被认为与肿瘤的恶性进展、预后不良密切相关，而且往往提示前列腺癌从激素依赖进入激素难治阶段。前列腺癌NE细胞通过分泌各种具有促进细胞有丝分裂的神经多肽作用于邻近的前列腺癌细胞，使得这些细胞获得雄激素非依赖性生长。二、研究目的通过缺氧及相关促红细胞生成素信号通路探讨前列腺癌LNCaP细胞的神经内分泌样细胞转化，并进一步阐述缺氧诱导的前列腺癌雄激素非依赖转化的具体机制。三、研究内容1、通过缺氧环境（37℃、5%CO2、1%O2的饱和湿度）以10%FBS-含酚红RPMI1640培养液持续培养2周，构建缺氧诱导下LNCaP细胞神经内分泌样转化的细胞模型，再通过western blot的方法鉴定缺氧诱导下LNCaP细胞神经内分泌样转化细胞的标记物。2、人类前列腺癌LNcap细胞SCID鼠原位移植模型的建立。3、通过免疫组化的方法检测雄性激素依赖和雄性激素非依赖前列腺癌组织中EPO和受体（EPOR）的表达。4、通过CCK-8法绘制缺氧诱导下LNCaP细胞神经内分泌样转化的细胞的生长曲线；通过RT-PCR和Western blot的方法检测缺氧培养前后LNCaP细胞EPO、EPOR、HIF-1α的变化；siRNA沉默EPOR，通过Western blot检测缺氧诱导下LNCaP细胞神经内分泌样转化细胞的标记物的变化。四、研究结果1、通过缺氧环境（37℃、5%CO2、1%O2的饱和湿度）以10%FBS-含酚红RPMI1640培养液持续培养2周后，LNCaP细胞呈神经内分泌样改变，再通过western blot的方法发现缺氧诱导的LNCaP细胞神经内分泌样转化细胞的标记物NSE和CgA表达增加。2、常氧培养前列腺原位组：13/15小鼠的前列腺生长出肿瘤，可见大部分前列腺腺体被肿瘤细胞破坏，仅见少量正常腺体结构，大量异型性上皮细胞，细胞胞核浓染，呈多形性，可见异常分裂相，胞浆可见有泡沫样的嗜伊红物质。皮下组：9/10小鼠皮下生长出肿瘤。缺氧培养前列腺原位组：4/4小鼠前列腺生长出肿瘤，可见大部分前列腺腺体被肿瘤细胞破坏，仅见少量正常腺体结构，大量异型性上皮细胞，细胞胞核浓染，呈多形性，可见异常分裂相，胞浆可见有泡沫样的嗜伊红物质，局部可见大量坏死组织。3、穿刺标本（雄性激素依赖组织）和电切标本（雄性激素非依赖组织）均存在EPO和EPOR过表达；穿刺标本和电切标本的EPO表达评分差异有统计学意义（p<0.001），穿刺标本和电切标本的EPOR表达评分差异有统计学意义（p<0.001）4、缺氧诱导的LNCaP细胞神经内分泌样转化细胞获得雄性激素非依赖生长。缺氧培养后LNCaP细胞EPO与EPOR的mRNA和蛋白的表达持续上升，HIF-1的mRNA和蛋白的表达先上升，后出现下降。siRNA沉默EPOR再行缺氧培养2周，LNCaP细胞NSE、CgA蛋白表达的下降。五、结论1、经缺氧2周培养，LNCaP细胞获得神经内分泌样表型，提示缺氧可能促进列腺癌激素非依赖进展。2、临床研究发现CRPC与内分泌治疗前的前列腺癌组织相比，免疫组化结果EPO和EPOR表达明显增强，提示EPO和EPOR自分泌环参与前列腺癌激素非依赖进展。3、长期缺氧时，EPO、EPOR持续上升，而HIF-1α表达下降，提示EPO-EPOR自主分泌环形成可能，并可能取代HIF-1α功能，而EPO通过前列腺癌细胞表达的功能性EPOR促进细胞凋亡抵抗及缺氧应激适应。