S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体内一种重要的中间代谢物,可作为药物和保健品,具有广阔的应用前景。本课题组在前期工作中构建了一系列合成SAM的重组毕赤酵母(Pichia pastoris):DS16(过表达高活性重组SAM合成酶),G12(弱化DS16中的β-胱硫醚合成酶基因cys4),G/Dspe(敲除DS16中的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2),DS16/DsvA和DS16/DsvP(敲除DS16中的spe2且敲入透明颤菌血红蛋白基因vgb,前者用PAOX调控vgb,后者为PsADH2)。为进一步促进SAM合成,我们以这些重组菌生理特性分析为基础,开展代谢工程研究。在正常摇瓶培养条件下,DS16/DsvA和DS16/DsvP的最大比生长速率和存活率均高于G/Dspe,且SAM体积产量分别提高了 14.3%和4.6%。在低氧摇瓶培养时,DS16/DsvA和DS16/DsvP仍可维持较高存活率,SAM体积产量比G/Dspe提高19.1%和9.6%。在5L罐中控制发酵过程溶氧为10～15%,诱导30 h后DS16/DsvA和DS16/DsvP的SOUR明显高于DS16和G/Dspe;发酵结束时,两株携带vgb基因的重组菌产量较高,其中DS16/DsvP的SAM产量最高,比DS16和G/Dspe分别提高了56.8%和17.0%,甲醇转化率分别提高1 00%和33.3%。摇瓶和发酵罐水平的结果都证实,在氧限制条件下,vgb基因的表达不仅能促进菌体生长,而且能够提高SAM产量。以DS16和G12为对象,利用基因芯片技术分析SAM合成对菌株转录谱的影响。对TCA循环,磷酸戊糖途径,嘌呤途径和氮代谢等途径中出现显著变化的基因进行分析,从中选择靶标基因进行敲除或强化,考察他们对重组菌生长和SAM合成的影响。在重组菌基因组中插入额外的mdh、idh、gnd和gln基因后,mdh和idh的过表达对SAM产量没有影响,强化gnd后SAM产量降低了 14.7%,强化gln后产量增加了 13.5%。敲除Rps28b基因后重组菌无法生长,敲除gdh2后SAM产量下降20.9%。这些结果可为不同重组菌的发酵过程优化和代谢改造提供有益的指导。