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目的:探讨瑞香素(daphnetin)即E003对反复自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)模型小鼠Th17/Treg失衡的免疫调节机制,进一步为瑞香素的药用价值开发和RSA的治疗提供理论和实验依据。方法:1.建立RSA模型小鼠:将雌性CBA/J和雄性BALB/c小鼠按照2:1的比例合笼交配建立正常妊娠模型小鼠,雌性CBA/J小鼠和雄性DBA/2小鼠按照2:1比例合笼交配建立RSA模型小鼠,两组小鼠以检出阴栓时计为妊娠第0天。2.实验分组及给药处理:(1)正常妊娠组;(2)RSA模型组;(3)E003低剂量组(1 mg/(kg?day))(4)E003高剂量组(4mg/(kg?day))。3.检测指标:(1)酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠外周血与蜕膜组织匀浆中的IL-2和IL-6表达;(2)流式细胞数检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17/Treg细胞比例;(3)实时荧光定量PCR检测PBMCs中叉头转录因子P3(transcription factor forkhead box P3,FoxP3)、孤核受体γt(orphan nuclear receptorγt,RORγt)、信号转导与转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)和信号转导与转录激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5,STAT5)mRNA的相对表达量;(4)蛋白质印记(Western blot)法检测各组小鼠蜕膜组织中STAT3和STAT5蛋白表达情况;(5)HE染色观察各组小鼠蜕膜组织病理结构改变;(6)透射电镜观察各组小鼠蜕膜组织中蜕膜细胞和血管的超微结构改变。结果:1.RSA建模为经典的建模方法,各组小鼠子宫胚胎图可见正常妊娠组子宫中胚胎数目很多,RSA模型组子宫胚胎数目整体较少,E003低剂量组胚胎数目较RSA模型组增加,E003高剂量组胚胎数目进一步增加。2.ELISA结果显示RSA模型组小鼠外周血和蜕膜组织匀浆中IL-2水平明显高于正常妊娠对照组,IL-6水平明显低于正常妊娠对照组;经E003处理后,RSA模型小鼠血清和蜕膜组织中IL-2水平明显降低,而IL-6水平明显升高,且呈剂量依赖性,即E003高剂量组效果优于E003低剂量组,差异均有统计学差异,P<0.05。3.流式细胞术结果显示RSA模型组小鼠较正常妊娠组小鼠PBMCs中Th17比率明显升高,Treg细胞比率明显下降,差异具有统计学差异,P<0.05;经E003灌胃治疗后,Th17比率明显下降,Treg细胞比率明显上升。Th17/Treg细胞比例RSA模型组明显高于正常妊娠组,E003治疗后,Th17/Treg细胞比例明显下降。4.RT-PCR检测各组小鼠PBMCs中Foxp3、RORγt、STAT3和STAT5 mRNA表达,结果显示E003处理组(E003高剂量组和E003低剂量组)Th17相关细胞因子Foxp3和STAT3 mRNA表达量较RSA模型组明显下降,而Treg相关细胞因子RORγt和STAT5 mRNA表达明显上升,差异具有统计学差异,P<0.05。5.Western blot进一步检测各组小鼠蜕膜组织中STAT3和STAT5蛋白表达,结果亦表明E003处理后STAT3蛋白表达明显下降,STAT5蛋白表达明显上升,差异均具有统计学意义,P<0.05。以上结果均显示E003可能通过调控RSA模型小鼠PBMCs和蜕膜组织中Th17和Treg相关细胞因子表达从而对Th17/Treg细胞免疫平衡起到一定的改善作用。6.HE染色结果显示RSA模型组较正常妊娠对照组可见蜕膜细胞碎裂,数量明显减少;E003低剂量组和高剂量组蜕膜细胞数量均较模型组增多,排列较整齐。7.透射电镜结果显示电镜下RSA模型组较正常妊娠对照组蜕膜细胞体积减小,细胞间隙明显增大,细胞核曲度增加;血管壁不完整,血管内皮细胞核呈梭形,内皮细胞结构不完整。E003低剂量组蜕膜细胞体积较模型组增大,细胞间隙较模型组稍增大;血管壁较RSA模型组完整,血管内皮细胞呈长梭形,内皮细胞结构较模型组完整。E003高剂量组蜕膜细胞体积较RSA模型组增大;血管壁较完整,血管内皮细胞结构较完整,细胞膜向腔面突起,血管由单个或多个血管内皮细胞环绕而成。结论:瑞香素E003通过调节Th17和Treg细胞相关细胞因子改善RSA模型小鼠外周血单个核细胞和蜕膜组织中Th17/Treg细胞失衡,并可修复RSA模型小鼠蜕膜组织中受损的蜕膜细胞,改善血管生成和血管细胞的完整性,从而对RSA模型小鼠具有一定的治疗作用。