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研究背景和目的：胸腺抗原特异性T细胞耐受的诱导和在外周的维持是预防自身免疫病的关键。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）作为一种专职的抗原提呈细胞，除了刺激作用外，许多证据表明其在维持和调节T细胞外周免疫耐受方面也具有重要作用。这种控制功能是由某种成熟阶段和不同来源亚型来决定，并受到某种免疫调节剂的影响。DC诱导T细胞耐受或T细胞活化取决于DC的成熟状态。在缺乏病原入侵或无炎症的稳定状态下，DC是以不成熟的形式存在。未成熟DC倾向于诱导免疫耐受的产生，成熟DC则倾向于诱导免疫应答。骨髓来源的DC倾向于诱导免疫应答，淋巴来源的DC则倾向于诱导免疫耐受的产生。近年来人们利用未成熟状态的DC具有诱导免疫耐受的能力，采用基因修饰、抗体技术、反义寡核苷酸技术以及体外培养等方法维持DC的未成熟状态，制备致耐受DC，在实体器官移植和自身免疫病的防治中起到了举足轻重的作用。IL-4基因修饰小鼠骨髓DC可显著减少小鼠的胶原诱导性关节炎发病。IL-10基因修饰的骨髓DC可显著延长同种心脏移植物的存活。用RNAi技术干扰DC的IL-12水平，可产生具有致T细胞免疫耐受的DC，即致耐受DC。尽管DC在免疫介导的疾病中起重要作用，但机体内DC的含量甚微，在外周血单个核细胞中不到1％，为痕量细胞群体。20世纪90年代DC体外大规模扩增技术的发展为DC的研究带来了前所未有的机遇。在低剂量的GM-CSF和IL-4的联合作用下可诱导骨髓前体细胞产生大量的DC。在DC体外大规模扩增技术的基础上，采用最近发展的RNAi技术（RNA interference，RNAi）针对影响DC发育成熟的关键基因NF-κB／RelB进行干预，筛选出干扰效率最高的shRNA，包装成慢病毒，感染骨髓DC（Bone marrow derived DC，BM-DC），获得RNAi RelB DC，并对RelB基因沉默的BM-DC进行形态学、表型和免疫功能的鉴定，以期构建出RelB基因沉默的新型致耐受DC，即RNAi RelB DC，研究其在T细胞免疫耐受诱导中的可能机制，为成功应用这种新型DC治疗移植排斥反应及自身免疫病提供一定的理论依据。方法：1、小鼠骨髓DC的体外培养和鉴定：无菌分离C57BL／6小鼠骨髓前体细胞，在低剂量的重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）作用下，经轻柔手法筛选并结合CD11c+免疫磁珠分选方法，培养扩增骨髓来源DC（BM-DC），并利用脂多糖（LPS）于细胞培养结束前24h刺激诱导DC成熟。实验分两组：①对照组DC（Control-DC）：经手法筛选后免疫磁珠分选体外培养第6天的DC，即未成熟DC；②脂多糖刺激DC组（LPS-DC）：在培养结束前24h终浓度为1μg／mL的LPS刺激DC，即成熟DC组。并在细胞形态、细胞表面分子表达和同种混合淋巴细胞反应（allogenic mixed lymphic reaction）免疫功能以及RelB基因表达水平等方面进行检测和鉴定。2、RNA干扰RelB基因慢病毒载体的构建与鉴定：根据不同成熟状态的骨髓DC表达RelB基因水平的不同，我们利用https://maidesigner.invitrogen.com/maiexpress/在线软件设计2个位点的RelB干扰序列。采用U6慢病毒表达载体系统构建目标基因RelB的慢病毒shRNA表达载体，经测序验证，在293FT细胞中包装病毒粒子，病毒包括3种，目标基因RelB的R2和R5以及阴性对照T6。分别对这3个病毒粒子进行滴度测定。采用体外培养第4天的骨髓来源的未成熟DC进行感染，利用RT-PCR和免疫荧光染色方法进行各感染组的RelB表达水平检测。同时设置未成熟DC对照组。3、骨髓致耐受树突状细胞的诱导及免疫功能研究：在有效沉默BM-DC表达RelB的基础上，进一步探讨RelB沉默的BM-DC的生物免疫学功能。实验设4组：①未成熟DC对照组；②LPS刺激成熟DC对照组；③RelB沉默的BM-DC组；④LPS刺激RelB沉默的BM-DC组。分别对这4组DC的形态、表面分子表达和细胞免疫功能（IL-12分泌水平、Th1／Th2细胞因子分泌、混合淋巴细胞反应等）方面探讨RelB沉默的BM-DC的生物免疫学功能。结果：1、在低剂量的rmGM-CSF和rm-IL-4的诱导下，成功地诱导出大量的骨髓DC，每2只小鼠获得BM-DC约1～2×107，基本上可满足实验需要。手法筛选的BM-DC的CD11c阳性细胞达70％，结合免疫磁珠分选后CD11c阳性细胞的可获得90％以上纯度的BM-DC。经流式细胞术鉴定，对照组DC（Control DC）低水平表达MHC-Ⅱ类分子、CD86和CD40，符合未成熟DC的特点，视为未成熟DC组；脂多糖刺激DC组（LPS-DC）高水平表达MHC-Ⅱ类分子、CD86和CD40，符合成熟DC的特点，视为成熟DC组。对上述2组的细胞形态学观察也显示Control DC细胞形态多为圆形，表面多褶皱，突起较少，细胞器较少，但细胞内含有较多的吞饮泡样结构；而LPS-DC细胞内囊泡样结构较少，细胞内线粒体和粗面内质网等细胞器丰富，细胞质回缩，突起明显。对DC分泌IL-12的水平的ELISA结果显示，Control DC的IL-12分泌水平显著低于LPS-DC（P＜0.01）。刺激同种异基因T细胞增殖（MLR）（P＜0.01）以及RelB基因表达水平的研究也得到了类似的结果。2、设计合成2个位点的RelB基因（NM 009046），行95℃退火处理，经4％琼脂糖凝胶电泳检测得到了退火产物dsOligo，将该产物与pENTRTM／U6连接，转化TOP10感受态细胞，卡那霉素抗性（50μg／mL）平板筛选阳性克隆，U6前引物（5’-GGACTATCATATGCTTACCG-3’）测序结果显示获得了阳性克隆。将目标基因阳性克隆质粒与慢病毒载体进行重组，转化Stb13感受态细胞，氨苄青霉素（Amp）抗性筛选后，进行30μg／mL氯霉素的LB平板中的药物负筛选，U6前引物测序再次表明2个位点的重组子均为阳性重组子。将阳性重组子与ViraPowerTM包装质粒混合物在质脂体LipofectamineTM 2000的介导下，在293FT细胞中包装病毒，收获含病毒的上清液，-80℃保存。利用系列稀释法(10-2～10-6)测定慢病毒贮液滴度，进行杀稻瘟菌素（浓度为10μg／mL）的药物筛选，感染的细胞形成肉眼可见的克隆，在显微镜下计数克隆数，测定病毒的滴度为6×105TU／mL（Transducing Unit（TU）／mL）。将2个位点的慢病毒和1个阴性对照对骨髓未成熟DC进行RNAi实验。流式表型分析各实验组DC表面分子表达水平，显示R5位点表面CD40分子表达最低，RT-PCR显示其中R5位点RelB基因表达较低；细胞免疫荧光分析结果也显示R5位点RelB蛋白表达水平也较低，也即R5位点干扰效果最好。3、用R5位点慢病毒感染未成熟BM-DC，发现细胞形态为圆形或椭圆性，细胞内有大量囊泡结构，部分囊泡可见吞噬的异物，细胞核多偏向一侧，溶酶体和线粒体等细胞器少，表面突起少，形态较规则。细胞表达MHC-Ⅱ类分子、CD40、CD86等表面分子较低，MLR显示较弱的刺激T细胞增殖能力。IL-12的ELISA结果显示细胞低水平分泌IL-12，MLR反应中诱导Th0向Th2细胞偏倚，IL-2和IFN-γ分泌抑制，IL-10和IL-4分泌相对占优势。结论：1、在低剂量的rmGM-CSF和nnIL-4诱导下，从小鼠骨髓前体细胞中可扩增得到大量的BM-DC。经小鼠CD11c+免疫磁珠阳性分选，可获得纯度高达90％以上的高纯度BM-DC。对成熟BM-DC和未成熟BM-DC进行免疫学功能及RelB基因表达水平的比较显示未成熟BM-DC倾向于诱导免疫耐受且低水平表达RelB基因，而成熟BM-DC倾向于诱导免疫应答且高水平表达RelB基因，RelB基因表达水平与DC的成熟状态有关。2、成功地构建了小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体，克隆出R2和R5两个位点的干扰载体，并进行慢病毒的包装和滴度测定。3、成功地获得了RNAi RelB DC，发现用R5位点的慢病毒感染未成熟DC，其干扰效果最好，且用该位点的慢病毒感染的DC其细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫学功能等均具有与未成熟DC相似的特点，且这种DC不能被LPS刺激成熟，具有致耐受DC特性，有望进一步应用于移植排斥反应及自身免疫性疾病的防治。主要创新点：1、首次利用慢病毒载体的方法对DC进行RelB基因的RNAi实验，并探讨其应用于自身免疫性疾病生物治疗的可行性，目前国内外尚未见类似报道。2、利用RNAi技术沉默BM-DC的RelB基因，获得了一个新的RelB基因沉默的有效位点，为RNAi数据库提供了新的有效作用位点。3、体外构建了RelB沉默的BM-DC，该DC表现为未成熟DC的形态和功能特点，是一种新型的致耐受DC。可能成为器官移植和自身免疫性疾病的生物制剂，为进一步应用RelB沉默的BM-DC的体内试验研究进行了有益的探索。