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背景临床上病理性心肌肥大往往是心力衰竭的早期表现,已被列为影响心血管疾病发病率和死亡率增高的独立危险因素。因此,探讨其发生机制并寻找有效的干预措施具有重要意义。已有文献报道,TLR4/IL-1R介导的细胞内信号转导在压力过负荷诱导的心肌肥大中发挥重要调控作用,但其细胞内信号转导调控的具体分子机制尚有待阐明。Triad3A是一种E3泛素连接酶,可将TLR4作为底物促使其发生泛素化依赖的降解,从而参与调控TLR4介导的信号转导。然而,Triad3A是否可在压力过负荷诱导的心肌肥大发展进程中发挥重要作用,目前尚不清楚。本论文着重探讨了 Triad3A在压力过负荷诱导的心肌肥大中的作用及其调控的分子机制。目的1.明确Triad3A在压力过负荷诱导心肌肥大中的作用。2.明确Triad3A在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大中的作用。13.阐明Triad3A在压力过负荷诱导心肌肥大中的分子调控机制。方法1.在体动物实验应用主动脉弓缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC)复制病理性心肌肥大模型。选择7-8周龄健康的C56BL/6雄性小鼠随机分为4组:假手术组(sham)、主动脉弓缩窄术组(TAC)、主动脉弓缩窄+对照病毒组(TAC+advGFP)以及主动脉弓缩窄+心脏过表达Triad3A组(TAC+advTriad3A)。手术后1周内检测左右侧颈总动脉血流速度比值评估手术缩窄程度,并取比值在7-10间的小鼠进行后续实验。术后2周测心超、取标本。2.体外细胞实验体外细胞实验采用血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作为刺激因素诱导心肌细胞肥大。分离1-2天新生大鼠心肌细胞,原代培养。首先观察不同浓度AngⅡ在不同刺激时间点下,对原代培养心肌细胞Triad3A蛋白和mRNA水平的影响;其次,构建腺病毒包装的Triad3A(advTriad3A),转染原代心肌细胞使其过表达Triad3A,48小时后给予AngⅡ刺激。体外实验分为四组:对照组(con)、血管紧张素Ⅱ刺激组(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ+转染对照病毒组(AngⅡ+advGFP)以及血管紧张素Ⅱ+转染腺病毒Triad3A组(AngⅡ+advTriad3A)。观察:①Triad3A对AngⅡ诱导的心肌细胞面积增大的影响;②Triad3A对AngⅡ诱导的肥大基因表达的调控;③Triad3A调控AngⅡ诱导心肌细胞肥大的分子机制。3.检测指标采用超声多普勒技术检测小鼠左右颈总血流比,了解TAC手术缩窄程度是否具有可比性;通过超声心动图检测心室壁厚度、室间隔厚度以及心功能的改变;取标本称量计算HW/BW和LVW/TL;HE染色观察心肌组织结构如心肌细胞横截面积的变化;实时定量PCR检测心肌肥大指标ANP、BNP、β-MHC基因表达水平;免疫荧光标记α-actinin检测体外原代培养心肌细胞面积的变化;采用免疫印迹实验检测Triad3A、TLR4、AKT、IκB、P65等蛋白表达水平;采用免疫共沉淀方法检测Triad3A和TLR4的结合、TLR4与下游MyD88蛋白结合情况、TLR4泛素化水平;采用电泳迁移率转移实验(EMSA)检测NF-κB结合活性。结果一、Triad3A参与压力过负荷诱导的心肌肥大1、TAC术后两周,TAC组小鼠的HW/BW和LVW/TL值均高于sham组。心超检测发现,与sham组相比,TAC组小鼠反映心脏结构变化的指标如心室壁厚度、室间隔厚度均明显增高,而反映心功能的指标短轴缩短率(FS%)和射血分数(EF%)则降低。上述检测指标的变化提示采用TAC复制心肌肥大模型成功。2、提取心肌组织蛋白,通过免疫印迹实验检测Triad3A蛋白表达水平,结果显示TAC手术2周后Triad3A蛋白表达明显低于sham组;提取心肌组织mRNA,通过实时定量PCR检测Triad3A mRNA水平,结果和蛋白趋势一致。提示,Triad3A表达的变化与压力过负荷诱导的心肌肥大发生发展密切相关。二、Triad3A参与血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大1、体外培养1-2天新生大鼠心肌细胞,给予AngⅡ刺激24小时诱导心肌细胞肥大。心肌细胞骨架蛋白α-actinin免疫荧光染色观察发现,与对照组相比,给予AngⅡ后心肌细胞面积明显增大;心肌肥大标志基因ANP、BNP、β-MHC mRNA水平,AngⅡ刺激组亦均明显高于对照组。2、AngⅡ刺激心肌细胞24小时后,提取各组蛋白和RNA,检测Triad3A蛋白和mRNA水平,AngⅡ刺激组均明显低于对照组,提示Triad3A表达的变化与血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大密切相关。三、心肌过表达Triad3A可抑制TAC所诱导的心肌肥大1、心肌局部过表达advTriad3A,TAC 2周后的超声心动图检测发现:过表达Triad3A可显著抑制TAC所诱导的心室壁厚度、室间隔厚度以及左心室内径增加,同时亦可明显改善TAC 2周诱导的心功能指标EF%和FS%的降低。2、心肌局部高表达advTriad3A,TAC 2周后取心脏标本,与病毒对照组相比,过表达Triad3 A组由TAC诱导的HW/BW和LVW/TL值的增高趋势被抑制。HE染色结果也表明心脏过表达Triad3A可改善TAC诱导的心肌细胞横截面积的增加。3、心肌局部过表达advTriad3A,TAC 2周后检测心肌肥大基因ANP、BNP、β-MHC表达,结果表明TAC诱导上述检测指标的上调,在过表达Truad3A时均可被抑制。四、心肌过表达Triad3A抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大1、转染心肌细胞病毒量(Multiplicity of infection,MOI)为25腺病毒Triad3A及其对照病毒advGFP不同时间点(0、24、48h),通过荧光和免疫印迹结果确定转染时间48h,Triad3A的表达效率最高。2、腺病毒转染心肌细胞48小时后给予浓度为10-6 μmol/1的AngⅡ刺激24小时。与转染对照腺病毒advGFP组相比,过表达Triad3A可缓解AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。表现为心肌细胞肥大指标ANP、BNP、β-MHC mRNA水平在过表达Triad3A后显著降低;免疫荧光α-actinin染色也显示同样趋势。上述结果提示过表达Triad3A可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。五、Triad3A在压力过负荷诱导心肌肥大中的分子调控机制1、Triad3A具有E3泛素连接酶活性,给予AngⅡ与其对照组相比,TLR4的泛素化水平没有明显差异,但过表达Triad3A显著增加心肌细胞中TLR4泛素化水平;过表达Triad3A,心肌细胞中AngⅡ诱导的TLR4与下游接头蛋白髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)结合的增高趋势被抑制。2、TLR4信号转导下游的IκB(Inhibitor of NF-κB)的磷酸化水平在TAC/AngⅡ诱导后显著增加,同时NF-κB的P65和50入核增多、NF-κB结合活性也增强。而过表达Triad3A后上述变化趋势被逆转。提示Triad3A可通过促进TLR4泛素化降解,抑制NF-κB结合活性调控心肌肥大发展。3、TAC/AngⅡ诱导AKT(proteinkinase B,蛋白激酶B)磷酸化水平升高,在过表达Triad3A后这一趋势被抑制,提示Triad3A可通过减少AKT磷酸化抑制心肌肥大。结论综上所述,Triad3A可参与压力过负荷诱导的心肌肥大,并对这一病理过程发挥一定的负性调节作用,其机制可能与其对TLR4受体的泛素化调控以及影响NF-κB结合活性和AKT磷酸化相关。