研究背景：近年来，甲状腺疾病的发生率逐年升高，特别是甲状腺功能亢进症(简称甲亢)的发生率达1％，放射性核素131I以其疗效确切和复发率低被越来越多的患者和临床医生认可。而且，131I在治疗结节性甲状腺肿、功能性甲状腺瘤、巨大甲状腺肿及甲状腺癌转移灶等方面也有很好的疗效。但其最大的不足是导致出现甲状腺功能减低症(简称甲低)，尤其一年后永久性甲低发生率以每年2％～5％的比例递增，这种副作用严重影响了131I治疗甲状腺疾病的发展和深入。此外，原发性甲低及甲状腺癌或甲亢手术后发生的永久性甲低也不少。甲低是一种严重影响人体生存质量的疾病，其目前的主要治疗方法是甲状腺激素替代治疗、异体或异位成体甲状腺移植、胎儿甲状腺供体移植等，但病人或难以接受终生服药的现实，或对甲状腺制剂过敏，甚至忌用(如冠心病人)。加上供体来源问题、移植物存活情况、移植排斥反应、移植后对其它器官的影响及远期疗效等环节的圆满解决仍需大量的投入研究。甲状腺细胞替代治疗可去除药物依赖而提高病人的生存质量并明显减轻免疫排斥反应及其对其它器官造成的损伤，给甲低的移植治疗带来新的希望，但仍存在细胞来源不足的困扰。 胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)具有两大特征——自我更新和多向分化潜能，且免疫原性低，自1981年小鼠ESCs成功建系以来，对其的研究和利用已成为生命科学的热点领域之一，利用ESCs已经在体外成功诱导分化为多种细胞并取得了较好的移植治疗效果。同样利用ESCs作为甲状腺细胞替代治疗的丰富细胞资源库在未来将成为可能，这无疑给甲状腺细胞替代治疗带来新的曙光，并有望从根本上解决甲低的移植治疗中移植细胞来源不足等问题。 研究目的： 1、探讨ESCs体外定向诱导分化为甲状腺细胞的可行性和相关调节因子。 2、初步尝试诱导细胞的相关功能研究，即体外对ESCs源性甲状腺细胞进行滤泡结构的构建(此部分尚处于实验阶段)。 实验方法优化ESCs培养条件，筛选生长状况良好、未分化的E14小鼠ESCs，模拟小鼠甲状腺细胞体内分化发育过程，定向诱导其分化为甲状腺细胞，即先将其悬浮培养诱导发育为胚胎体(embryoidbodies，EBs)，再继续贴壁诱导EBs分化，在不同时间段分别在细胞培养基中添加TSH、insulin、KI等生长因子。倒置相差显微镜下观察细胞分化过程的形态学变化，并以体外培养的成年小鼠甲状腺细胞为阳性对照；RT-PCR法检测甲状腺细胞分化相关基因TSHR、PAX8、NIS、TPO、Tg等表达情况；免疫荧光细胞化学分析法检测甲状腺细胞分化标记物TSHR、PAX8、TTF-2、TTF-1等的表达。利用鼠尾胶原凝胶基质作为支架对诱导细胞进行体外滤泡结构的构建。 结果：胚胎干细胞在重组小鼠白血病抑制因子(rmLIF)存在条件下保持未分化生长状态，撤去rmLIF后很快发育为胚胎体并继续分化。RT-PCR可检测到第8天分化细胞中有甲状腺细胞分化特有基因PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR等的表达；免疫荧光细胞化学分析可检测到第8天分化细胞中甲状腺细胞分化标记物TSHR、TTF-1强表达，而PAX8、TTF-2弱表达；第10天所有甲状腺细胞分化标记物均强表达；阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞。已经成功制备了高质量的鼠尾胶原凝胶基质，相关功能研究仍在进行中。 结论：胚胎干细胞经过胚胎体发育阶段，在特定培养条件和生长因子的作用下可定向诱导分化为甲状腺细胞。该诱导分化体系为甲状腺疾病细胞替代疗法中的新型甲状腺细胞来源奠定了实验基础。但因尚未找到甲状腺细胞特有的表面标记分子，所以获得单一诱导的甲状腺细胞仍是一个具有极大挑战性的课题，下一步实验将继续利用激光共聚焦显微镜对诱导细胞进行双色免疫荧光细胞化学分析，以明确诱导细胞产物的类型和比例。同时要得到高分化率的目的细胞及目的细胞的纯化和相关功能研究也有待于进一步的实验探索。