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目的:以人源性A549细胞为研究对象,从体外构建百草枯(Paraquat,PQ)致肺纤维化模型,初步探讨TSP-1及其受体CD47在PQ致肺纤维化中的作用及其可能的发病机制。方法:体外培养人A549细胞,首先分为正常组对照组、PQ组、空白对照组,采用CCK-8法检测不同浓度(50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM)的PQ刺激不同时间(12h、24h、48h)对细胞存活率的影响,以细胞半数存活率为标准筛选出作用于后续试验的浓度和时间点。此后分为正常组、PQ组,PQ组下设1个时间点(24h)和3个浓度(50μM、100μM、200μM)。倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法测定纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、I型胶原的相对表达量;免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)法观察TSP-1、CD47的蛋白表达情况;免疫荧光双染(Immunofluorescence double staining)观察TSP-1、CD47共表达;实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)检测TSP-1、CD47mRNA的表达量,Western印迹法(Western Blot,WB)检测TSP-1、CD47蛋白表达;流式细胞仪检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平。最后,再分为正常组、PQ组、Anti-TSP1组(PQ+TSP1中和抗体),PQ组下设1个时间点(24h)和1个浓度(200μM);Anti-TSP1组(24h)加入TSP1中10μg/ml与200μM的PQ共培养。再次观察细胞存活率、细胞形态、TSP-1和CD47基因和蛋白水平、细胞内ROS水平和FN、I型胶原表达变化。结果:1.PQ作用时间一定时,细胞活力随PQ浓度增加而降低,呈时间浓度依赖性;与正常组相比,除50μM的PQ作用12h时的细胞的活力下降没有统计学意义(P>0.05)外,其余均有统计学差异(P<0.05);2.正常组细胞连接紧密,形态均一,呈鹅卵石状,排列整齐,岛状或成团生长,贴壁强、增殖能力强;PQ组细胞随着PQ浓度增加,细胞间隙逐渐增大,形态逐渐变得不均一、无规则,伸出不规则突起,呈纺锤体形或长梭形,排列紊乱,增殖能力逐渐减弱;3.随着PQ作用浓度增加,与正常组相比,PQ组FN、I型胶原的相对表达量逐渐增多,呈浓度依赖性,以200μM时最为明显;4.随着PQ作用浓度增加,与正常组相比,PQ刺激组TSP-1、CD47 mRNA水平表达上调、蛋白表达量明显增加,以200μM时最为明显;5.与正常组相比,PQ组TSP-1、CD47蛋白表达量明显增加,均以200μM时最为明显;TSP-1、CD47在细胞质中存在共表达;6.与正常组相比,ROS水平在24h时明显升高。加入TSP1中和抗体后,与PQ组相比,Anti-TSP1组细胞活力明显增加,形态向正常细胞形态变化;TSP-1、CD47的mRNA水平及蛋白表达量下降;ROS的过表达受到抑制;FN、I型胶原的相对表达量减少。结论:1.200μM的PQ刺激A549细胞24h能够成功构建体外肺纤维化模型;2.PQ刺激A549细胞后可诱导TSP-1和CD47的表达,且在细胞质中存在共表达;3.PQ可刺激A549细胞发生氧化应激;4.TSP-1中和抗体可下调TSP-1、CD47 mRNA水平及蛋白表达量,抑制氧化应激状态,降低FN、I型胶原表达量;5.TSP-1-CD47可能通过诱导氧化应激参与了PQ致肺纤维化过程。