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烟草是植物生物学研究的模式植物,又是世界上重要的经济作物,随着二倍体烟草全基因组测序的完成,烟草研究进入了后基因组学时代。在功能基因组学时代,突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一。本研究作为烟草基因组计划重要组成部分之一,构建了烟草激活标签突变体库,并从突变表型观察、T-DNA插入位点分布规律和插入位点旁侧基因的表达分析三个方面对该突变体库做出评价,为大规模挖掘烟草基因的功能奠定基础。1.本研究以烟草主栽品种“红花大金元”为受体,利用优化的农杆菌介导的遗传转化方法,创制了10万份激活标签(pSKI015)突变体。在遗传转化过程中,采用100-150 mg/L的特美汀(Timentin)有效抑制细菌的生长；将暗培养时间延伸至共培养后的第一轮筛选,提高了烟草的再生效率；高强度的Basta筛选压力,产生了高阳性率的转基因植株(90%)。对34份转基因株系southern blot分析显示,88%的测试株系含有一到两个T-DNA插入,平均1.6个拷贝,因此10万份突变体包含14.4万个T-DNA插入。2.本研究经过三年的大田突变表型鉴定,累计鉴定近千份具有突变表型的突变体,突变类型主要包括叶形态、花形态、株高、分枝、腋芽、育性、花期等。2012年种植了4,105份T1代株系,共鉴定出311份具有突变表型的T1代株系,2013年种植其中234份有突变表型的T2代株系,调查表型在T1和T2代间的遗传规律,59份(1/4)T2代植株保持了T1代的表型,其中36份(1/6)呈现出显性和半显性表型。3.本研究利用融合嵌套PCR (FPNI,fusion primer and nested integrated PCR)方法扩增1,257份转基因植株,测序1,417条序列,通过blast程序与烟草基因组进行比对,获得了998条侧翼序列(FSTs,Flanking sequence tags),共计963个单一的T-DNA插入位点。通过插入位点在烟草基因组的分布规律进行分析显示,T-DNA在烟草中插入位点密度和基因密度呈现正相关。对插入位点区间分布进行分析显示,T-DNA在烟草中偏向插入到基因区和基因周围5kb范围内的区域,在基因区范围内,偏向于插入到UTR区,和3’UTR相比较,更偏向于5’UTR区。4.本研究利用半定量PCR对15份在T2代有突变表型的株系进行基因的表达分析,在15个最靠近插入位点的候选基因中,其表达量上调有7个,其中6个靠近T-DNA的右边界,1个靠近不含增强子序列的T-DNA左边界。其激活距离在750bp和13.1kb之间。激活基因分布在T-DNA插入位点的上下游和左右边界两侧,表明T-DNA中的增强子元件在烟草基因组中的激活作用和方向无关。并且发现激活的程度和激活距离无相关性。