研究背景整联蛋白连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)第一次被发现于1996年,是一种定位于细胞粘着斑部位的丝氨酸／苏氨酸的蛋白激酶。现已探明,ILK在多种细胞通路和功能中起到至关重要的作用,包括细胞的生长、发育、分裂、增殖、分化、迁移和血管发生等。很多研究表明,在病变的癌细胞中,ILK的表达较之正常细胞明显升高,说明其对癌症的发生和治疗密切相关。目前的研究表明,ILK在神经系统的各个脑区都有很高的表达量,说明它可能在神经系统中也发挥着巨大作用。通过基因敲除ILK的方法检测发现,与正常小鼠相比,基因敲除ILK的小鼠神经系统发育出现了缺陷,其皮层结构完全紊乱,小脑脑叶数目减少,脑叶融合,海马齿状回部位出现了锯齿状的颗粒层结构等等。进一步的研究发现,神经生长因子(nerve growth factor, NGF)刺激下引起的突起生长或是树突生长依赖于ILK的作用,当抑制ILK之后,突起生长明显受到抑制,这些结果,都说明ILK在神经系统的正常生长发育过程具有重大意义。然而,目前关于ILK在成年动物高级功能如学习记忆中的作用以及机制尚不清楚。本论文使用多种研究方法从分子到整体水平阐明了ILK在丰富环境增强记忆中的作用及机制,并初步探究了其在改善APP/PS1转基因小鼠记忆缺陷中的作用,为今后临床治疗阿尔兹海默病提供了实验依据。研究目的1.ILK是否参与丰富环境增强记忆的过程。2.ILK通过何种机制参与丰富环境增强记忆的过程。3.调节ILK的功能能否改善APP/PS1转基因小鼠记忆能力的缺陷。研究方法1.丰富环境训练以及ILK蛋白、mRNA检测1.1丰富环境训练将小鼠置于放置有滚轮、梯子、隧道、滚球等玩具的环境中,观察随着时间推移ILK蛋白量的变化。1.2ILK蛋白、mRNA检测采用western blotting和RT-PCR的方法,检测ILK蛋白和mRNA水平的变化。2.病毒干预对神经再生和学习记忆的影响2.1慢病毒干扰和过表达采用PGW和PCCL两种改造质粒制作ILK的干扰病毒和过表达病毒,采用显微注射的方法,注射到小鼠海马齿状回区,一个月后检测学习记忆和神经再生。2.2神经再生的检测将各组的小鼠进行灌流取脑后,冠状切片进行BrdU染色,统计新生细胞的数目。2.3学习记忆模型我们采用海马相关的环境依赖性的条件恐惧模型和水迷宫模型,来分别评价小鼠的恐惧记忆和空间记忆。3. APP/PS1转基因小鼠模型采用APP/PS1双敲入转基因小鼠模型来模拟人阿尔兹海默病,进行实验评价。该小鼠在五个月之后脑内即可产生大量Aβ富集的老年斑,出现与人阿尔兹海默病类似的生理现象。实验结果1.丰富环境刺激后小鼠海马ILK蛋白表达明显升高我们在给予小鼠丰富环境刺激之后连续四周取小鼠海马脑区检测,发现从第二周开始小鼠海马脑区的ILK蛋白和mRNA水平开始升高,三四周达到最高值并一直维持。2. ILK参与丰富环境引起的神经再生和学习记忆的增强2.1ILK参与丰富环境提高的学习记忆丰富环境刺激一个月后,小鼠进行空间记忆和环境条件恐惧记忆检测,发现小鼠Morris水迷宫训练阶段找到水下平台的潜伏时间显著减少,测试阶段在平台所在象限的逗留时间则显著增加,说明其空间记忆增强。同时,经过丰富环境刺激后的小鼠在contextual fear conditioning测试阶段的freezing时间显著提高,说明丰富环境能增强环境条件恐惧记忆。但降低ILK表达之后,丰富环境刺激引起的学习记忆增强则被抑制。2.2ILK参与丰富环境提高的神经再生丰富环境刺激一个月后,小鼠海马齿状回部位的BrdU阳性细胞数目及BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增加,说明丰富环境刺激引起小鼠齿状回统计再生的增殖与存活过程增强。当我们降低齿状回部位ILK的表达之后,检测发现BrdU阳性细胞数目及BrdU和NeuN双阳性细胞数目均下降,说明给予丰富环境刺激引起的神经再生增殖和存活能力的增强被抑制。。3. ILK参与丰富环境引起的神经再生和学习记忆增强的机制。3.1丰富环境过程中GSK3β活性的变化丰富环境刺激四周之后,ILK的下游分子糖原合成激酶3β (GSK3β)9位点丝氨酸的磷酸化水平升高。而在ILK被损伤的小鼠中,其GSK3β9位点丝氨酸的磷酸化水平则相应降低。ILK降低之后,给予丰富环境刺激的小鼠其GSK3β9位点丝氨酸的磷酸化水平依旧比正常小鼠要低。3.2GSK3β的抑制剂SB216763能够逆转ILK降低导致的神经再生和学习记忆损伤我们给予腹腔注射SB216763连续两周,检测Morris水迷宫和contextual fear conditioning之后发现,原本降低ILK之后导致水迷宫训练阶段潜伏期延长、测试阶段在平台象限逗留时间降低以及contextual fear conditioning测试的freezing时间减少,而给予SB216763之后能够逆转这种损伤。我们检测海马齿状回部位神经再生,统计发现降低ILK后损伤后BrdU阳性细胞以及BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著降低,而给予SB216763后能够逆转这种损伤。4.增强ILK能够缓解APP/PS1转基因小鼠的记忆缺陷4.1在APP/PS1转基因小鼠中ILK的改变及学习记忆缺陷我们检测发现,在APP/PS1转基因小鼠中,ILK的表达明显下降,通过检测发现,转基因小鼠齿状回部位BrdU和NeuN双阳性细胞数目减少,说明APP/PS1小鼠的神经再生存活受损。我们通过Morris水迷宫检测发现转基因小鼠的水迷宫训练阶段潜伏期延长,测试阶段在象限内时间较少。在contextual fear conditioning模型检测发现转基因小鼠的freezing时间降低,说明其记忆能力受损。4.2增强ILK可以缓解APP/PS1转基因小鼠的神经再生和记忆损伤我们采用过表达病毒在小鼠海马脑区增强ILK之后,检测发现增强ILK之后BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增强,说明原本受损伤的神经再生得到了缓解。通过Morris水迷宫检测发现,增强ILK后降低了转基因小鼠的潜伏时间、延长了小鼠在平台象限内的逗留时间；检测contextual fear conditioning发现,增强ILK延长了测试阶段转基因小鼠的freezing时间。4.3盐酸氟西汀对APP/PS1转基因小鼠的作用我们给予APP/PS1转基因小鼠连续注射氟西汀四周,检测发现氟西汀使得转基因小鼠BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增强,说明原本受损伤的神经再生得到了缓解。通过Morris水迷宫检测发现,给予氟西汀之后降低了转基因小鼠的潜伏时间、延长了小鼠在平台象限内的逗留时间；检测contextual fear conditioning发现,给予氟西汀延长了测试阶段转基因小鼠的freezing时间。实验结论1. ILK在丰富环境过程中表达增加,并且干预ILK之后原本丰富环境增强的神经再生学习记忆都受到损伤,说明其参与丰富环境对学习记忆能力增强的过程.2. ILK在丰富环境中发挥作用依赖于下游分子GSK3β的作用。给予GSK3β的抑制剂SB216763能够纠正ILK干预引起的神经再生和学习记忆的损伤。3.增强ILK能够缓解APP/PS1转基因小鼠的神经再生和学习记忆损伤,说明ILK可能与阿尔兹海默病十分相关。我们给予能够刺激神经再生的抗抑郁药盐酸氟西汀同样也能缓解APP/PS1转基因小鼠的记忆损伤,这给临床治疗阿尔兹海默病提供了新的思路。创新性1.发现了ILK能够通过影响海马齿状回的神经再生而参与丰富环境增强记忆的行为过程。2. ILK对丰富环境过程中神经再生和学习记忆的影响依赖于它的下游分子GSK3β。3.发现增强ILK能够缓APP/PS1转基因小鼠的神经再生和学习记忆的损伤。