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背景:根据2018年全球癌症统计报告,全世界每年约有超过83万人被诊断为头颈癌。而好发于口腔、口咽、下咽和喉部的头颈鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC,简称头颈鳞癌)占了所有头颈癌的90%,并且其中约一半的患者将在5年内死亡。诱发头颈鳞癌的典型危险因素包括吸烟、饮酒、嚼槟榔以及人类乳头瘤病毒(HPV,human papillomavirus)感染。头颈鳞癌易复发和转移,目前针对头颈鳞癌的主流治疗方法为手术、化疗和放疗结合的综合策略。近几十年来,尽管我们对其流行病学和发病机理的认识以及治疗手段都有所提高,但是头颈鳞癌患者的5年生存率却没有得到显著改善。慢性炎症是公认的癌症生物学特点和病因之一,在包括头颈鳞癌在内的多种肿瘤的发生发展、侵袭转移以及免疫抑制等方面起到主导作用。近期研究发现炎症反应所必需的转录因子NF-κB可能是介导“炎癌转化”机制的重要桥梁之一。肿瘤干细胞(CSCs,cancer stem cells)是一群具有高度自我更新能力的细胞,被认为是肿瘤启动、复发转移和化疗抵抗的主要元凶,而有证据表明NF-κB通路介导的炎症与肿瘤干细胞特性的获得关系密切。此外,头颈鳞癌也是一种免疫抑制性肿瘤,可通过调控肿瘤细胞免疫原性、分泌免疫介质以及募集免疫抑制性细胞等机制诱导肿瘤免疫逃逸,而慢性炎症在上述过程中也扮演了重要角色。炎性小体(inflammasomes)是一类大分子蛋白复合物,作为“危险”信号感受器,是机体炎症反应的中心环节。其中NLRP3(NOD样受体蛋白3,Nod-like receptor protein 3)是目前研究最广泛的炎性小体,它由NLRP3、ASC(凋亡相关斑点样蛋白)和Caspase-1(半胱天冬酶1)构成,通过介导促炎细胞因子白细胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素 18(interleukin-18,IL-18)的成熟和释放对抗感染和创伤。NLRP3炎性小体在感染性和自身免疫性疾病中发挥重要作用,但它们在肿瘤进展中的作用仍不明确。NLRP3炎性小体能够对肿瘤生物学的多个方面产生不同的、甚至是完全相反的影响,这取决于特定的环境。目前,IL-18在肿瘤中的作用还存在诸多争议,相比之下,IL-1β的促瘤作用较为明确。研究表明NLRP3炎性小体介导分泌的IL-1β可以直接影响肿瘤细胞的增殖、生存及转移等能力,或通过促进免疫抑制间接影响肿瘤的进展。但是目前NLRP3炎性小体与肿瘤进展相关的证据仍处于初步研究阶段,还需要进一步探索。尤其是头颈鳞癌,NLRP3炎性小体与之相关的研究甚少,这促使我们探索NLRP3炎性小体在头颈鳞癌进展中的具体作用。第一部分 NLRP3炎性小体调控头颈鳞癌肿瘤干细胞形成的研究目的:明确NLRP3炎性小体在人类和小鼠头颈鳞癌组织以及人类头颈鳞癌细胞系中的表达情况;探究NLRP3炎性小体及其组分NLRP3、ASC和Caspase-1与头颈鳞癌患者生存预后的关系;分析NLRP3炎性小体与CSCs标记物的相关性;通过体内和体外实验,探索NLRP3炎性小体激活与头颈鳞癌CSCs形成的关系。方法:通过查询TCGA数据库,明确头颈鳞癌中NLRP3、PYCARD(ASC编码基因)、CASP1(Caspase-1编码基因)、IL1B和IL18的mRNA水平。利用免疫组化技术检测NLRP3炎性小体在人类头颈鳞癌组织芯片以及Tgfbr1/Pten 2cKO头颈鳞癌小鼠肿瘤组织中的表达情况;并基于皮尔森相关性系数,分析其与CSCs指标(CD44、ALDH1和BMI1)表达的相关性。利用Western blot技术检测NLRP3炎性小体各组分在头颈鳞癌细胞系(SCC9、SCC25、FaDu和CAL27)的表达水平,随后利用NLRP3炎性小体的小分子抑制剂MCC950和激活剂(LPS+ATP)探索了 NLRP3炎性小体活性与头颈鳞癌细胞系CSCs形成的关系:采用成球实验(sphere formation)和克隆形成实验(colony formation)检测肿瘤细胞自我更新能力的变化;Western blot和免疫荧光染色技术检测CSCs相关蛋白的表达。最后使用MCC950预防性治疗头颈鳞癌小鼠模型,评价NLRP3炎性小体作为治疗靶点的可行性,并采用免疫组化和Western blot实验检测用药后肿瘤组织中NLRP3炎性小体各组分以及CSCs标志物的变化。结果:TCGA数据库的结果显示,除了IL18以外,NLRP3、PYCARD、CASP1和IL1B在头颈鳞癌中的表达均高于对照正常组织。NLRP3、ASC、Caspase-1在人类和小鼠头颈鳞癌标本的表达均显著高于正常粘膜组织,且其中高表达ASC的患者可能具有更差的预后(P<0.05)。此外,NLRP3炎性小体组分与CSCs标志物BMI1、ALDH1和CD44的表达呈正相关。头颈鳞癌细胞系中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β也处于过表达状态,联合使用LPS和ATP激活NLRP3炎性小体促进了 CAL27细胞中BMI1、ALDH1和CD44表达,并且增强了 CAL27细胞的自我更新能力(P<0.001);而使用MCC950阻断NLRP3炎性小体活化后,CAL27细胞的成球和克隆数目明显减少(P<0.001),BMI1、ALDH1和CD44的表达量也明显降低。在头颈鳞癌小鼠模型中,MCC950治疗能够抑制肿瘤生长,并且减少了肿瘤组织中的NLRP3炎性小体以及CSCs相关蛋白的表达。结论:第一部分的研究表明,NLRP3炎性小体在人类和小鼠头颈鳞癌中处于过表达状态,并且与肿瘤干细胞特性密切相关。NLRP3炎性小体的激活是头颈鳞癌的促瘤信号,抑制NLRP3炎性小体活化能够抑制肿瘤进展以及CSCs的形成。第二部分 NLRP3炎性小体促进头颈鳞癌免疫抑制微环境形成的研究目的:分析NLRP3炎性小体活化与免疫抑制性因子和细胞的相关性;在头颈鳞癌小鼠模型中,研究NLRP3炎性小体/IL-1β信号对免疫抑制细胞招募,以及T细胞耗竭的影响,探索NLRP3炎性小体在头颈鳞癌肿瘤免疫抑制微环境中的作用。方法:利用TCGA头颈鳞癌数据库和皮尔森相关系数,分析IL1B与NLRP3炎性小体各组分、免疫抑制性细胞因子(TGFB1、IL6和IL10)、免疫抑制细胞相关趋化因子(CCL2和CXCL1)以及CD47-SIPRα靶点(CD47和SIPRA)的相关性。随后采用ELISA检测人类头颈鳞癌病人血液,头颈鳞癌荷瘤小鼠的血液、脾脏、淋巴结及肿瘤组织中IL-1β的含量。利用头颈鳞癌小鼠模型,探索两种剂量MCC950治疗的效果差异,并使用ELISA检测用药后各组织中IL-1β的含量变化。采用流式细胞术分别检测三组荷瘤小鼠中免疫抑制性细胞:CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞(Tregs,regulatory T cells)、CD11b+Ly6Chigh 单核型和CD11b+Ly6G+粒细胞型髓源性抑制细胞(MDSCs,myeloid-derived suppressor cells)、CD11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs,tumor-associated macrophages)以及CD4+,CD8+效应T细胞数目的变化;同时检测负性免疫检查点PD-1、TIM-3在T细胞上的表达变化。此外,采用免疫组化或者免疫荧光染色检测上述细胞在小鼠肿瘤组织中的分布情况。最后利用皮尔森相关性分析与聚类分析评估NLRP3炎性小体与这些细胞的特异性标记物在人类头颈鳞癌中的相关性。结果:第一部分研究的结果提示,相对于IL-18,IL-1β的在头颈鳞癌中促瘤作用更为明确。TCGA数据库的相关性分析表明,IL1B跟NLRP3炎性小体组分、免疫抑制性因子(TGFB1、IL6和IL10)、免疫抑制细胞相关趋化因子(CCL2和CXCL1)以及CD47-SIPRα靶点(CD47和SIPRA)均具有良好的正相关性。IL-1β在头颈鳞癌病人(n=10)血液中的含量明显高于正常人(n=10,P=0.001),这一结果也在头颈鳞癌小鼠模型中得到了验证。通过MCC950阻断NLRP3炎性小体的活化能够有效地降低荷瘤头颈鳞癌小鼠体内IL-1β含量,并且伴随着免疫抑制细胞(MDSCs、TAMs和Tregs)以及PD-1、TIM-3耗竭T细胞数目的明显减少;同时增加了 CD4+和CD8+T细胞的数目。在人类头颈鳞癌组织芯片中,NLRP3、ASC 和 Caspase-1 的表达与 Tregs 标记物 Foxp3,MDSCs 标记物 CD11b和CD33,TAMs标记物CD68和CD163以及负性免疫检查点分子PD-1和TIM-3呈正相关。结论:第二部分的研究表明,头颈鳞癌中NLRP3炎性小体/IL-1β信号通路的激活与肿瘤免疫抑制状态关系密切。在头颈鳞癌小鼠中阻断该信号能够减少免疫抑制细胞的募集,改善免疫抑制炎性微环境,从而一定程度恢复抗肿瘤免疫反应。