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目的：克隆大鼠睫状神经营养因子（cilicry neurotrohic factor，CNTF）的开放读码框，构建重组质粒pAAV-CNTF-EGFP，包装携带CNTF重组腺相关病毒。 方法：1)克隆大鼠CNTFcDNA：选用健康成年SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠，分离两侧坐骨神经，利用Trizol试剂盒提取其总RNA；RT-PCR扩增大鼠CNTF cDNA片段，克隆到pUcm-T载体（即pUcm-CNTF）。2)构建pAAV-EGFP质粒：从pEGFP-N1中扩增EGFP cDNA，经Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pAAV-MCS中，转化大肠杆菌，筛选阳性重组子，构建相应的腺相关病毒质粒pAAV-EGFP。3)构建pAAV-CNTF-EGFP：CNTF cDNA插入到pAAV-EGFP中EGFP的上游，构建携带CNTF和EGFP的重组AAV病毒载体：pAAV-CNTF-EGFP。4)重组质粒的鉴定：应用酶切分析及DNA测序鉴定插入片断与开放读码框的正确性。5)细胞转染：利用脂质体法将重组质粒pAAV-EGFP、pAAV-CNTF-EGFP分别和辅助质粒pAAV-RC、pHelper共转染AAV293细胞。6)检测融合蛋白CNTF-EGFP的表达：利用荧光显微镜观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达，免疫细胞化学法和Western blot检测转染细胞中CNTF的表达情况。 结果：克隆了大鼠CNTFcDNA，成功构建了携带CNTF和EGFP的重组AAV病毒表达载体，pAAV-CNTF-EGFP。重组质粒pAAV-EGFP、pAAV-CNTF-EGFP分别和辅助质粒pAAV-RC、pHelper共转染AAV293细胞48h后，荧光显微镜下观察到转染细胞中有绿色荧光；免疫细胞化学法观察到转染pAAV-CNTF-EGFP细胞核及核周胞浆被染成棕黄色，而转染空载体pAAV-EGFP和未转染组的293细胞无明显着色；Western Blot结果进一步证明构建的pAAV-CNTF-EGFP载体能在293细胞中包装成AAV病毒及表达目的基因CNTF蛋白。