论文部分内容阅读
背景溶血素(pneumolysin, PLY)是肺炎链球菌一个重要的毒力因子,具有溶细胞活性、补体激活和诱导细胞凋亡等多种生物学功能,但其具体在细菌感染宿主的哪些环节发挥作用,目前尚不十分清楚。本研究通过比较Ply全基因缺陷菌株与野生菌株在定植、侵袭及血中存活能力的差异,确定PLY在细菌感染过程中发挥作用的具体环节。结果显示,PLY在细菌损伤肺组织、突破肺部毛细血管屏障中具有重要作用。而近期研究显示,在肺炎链球菌导致的肺部损伤中,PLY的细胞凋亡诱导作用较其细胞毒性作用更强,但具体涉及哪些类型细胞尚不清楚。由于肺部巨噬细胞是这一屏障的重要组成部分,且已有研究显示PLY可诱导巨噬细胞的凋亡,提示PLY诱导肺部巨噬细胞的凋亡可能是其至肺部损伤、帮助细菌侵袭入血的一个重要因素。虽有研究显示这一过程依赖于TLR4,但其具体的分子机制尚不十分清楚。因此,本研究后部分实验就以小鼠肺泡巨噬细胞RAW264.7为模型细胞,探索PLY引起巨噬细胞凋亡的具体分子机制,为深入阐明肺炎链球菌PLY的致病分子机制提供有价值的实验证据。方法采用长臂同源多聚酶链反应(Long flanking homologypolymerase chain reaction,LFH-PCR)方法构建溶血素缺陷菌株,利用小鼠体内实验研究溶血素对细菌毒力的影响;利用纯化的PLY蛋白处理RAW264.7细胞后,通过倒置显微镜的细胞形态观察,MTT增殖实验,DNA Ladder分析,流式细胞检测等鉴定细胞凋亡;通过ELISA检测Caspase-3、8、9活性,通过免疫组织化学分析Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建Ply缺陷菌。该缺陷菌株入血时间(6h)明显晚于野生菌株(2h),且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌株腹腔感染小鼠的中位生存时间为18天,野生菌株中位生存时间为3天,两者比较有统计学差异(P<0.01)。溶血素处理RAW264.7细胞后,倒置显微镜可见RAW264.7细胞典型的凋亡形态学改变;MTT增殖实验显示溶血素对RAW264.7细胞有明显增殖抑制作用,而且呈现出时间和浓度依赖性;流式细胞仪分析结果显示,0.5 ug/ml PLY蛋白处理RAW264.7细胞24h和48h的早期凋亡率分别为7.42%和15.64%,1ug/ml PLY蛋白处理RAW264.7细胞24h和48h的早期凋亡率分别为43.33%和55.43%(P<0.05);琼脂糖凝胶电泳染色体DNA可见典型的凋亡“梯状”条带;溶血素处理RAW264.7细胞后,发现Caspase-3、8、9活性均增高;且凋亡相关蛋白Bax、Fas表达增高,Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论肺炎链球菌缺陷溶血素Ply基因后,细菌的侵袭能力和血中生存能力显著降低,提示PLY在细菌损伤肺组织、突破肺部毛细血管屏障中具有重要作用,其中可能涉及诱导肺泡巨噬细胞的凋亡。对RAW264.7细胞凋亡相关研究结果显示,溶血素可以在体外诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞的凋亡,其诱导凋亡的机制涉及死亡受体/Fas途径和线粒体途径的双重调控作用。