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背景与目的:近年静脉溶栓的普及和血管内治疗的开展,给缺血性卒中患者带来希望。但血管再通后继发的再灌注损伤可导致脑损伤和功能损害进一步加重。目前认为,干预脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion,I/R)对于缺血性脑卒中的防治具有重要的意义。迷走神经电刺激(vagus nerve stimulation,VNS)早在1997年通过美国食品和药品监督局批准,应用于临床治疗难治性癫痫患者。近年国内外研究显示,VNS对大鼠脑I/R损伤具有神经保护作用。国外一项临床试验已经表明,VNS联合康复训练治疗上肢无力的缺血性脑卒中患者是可行的。然而,关于VNS对缺血性脑卒中的具体保护机制,国内外仍缺乏系统而深入的研究。脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(Lipocalin-type prostaglandin D synthase,L-PGDS)是一种双功能蛋白质,具有催化前列腺素D2合成和转运亲脂性物质的作用。L-PGDS在中枢神经系统(central nerous system,CNS)中表达量丰富,并有益于保护脑缺血损伤。但L-PGDS在CNS特别是缺血性脑卒中中的作用机制不明。本研究拟通过VNS干预对大鼠脑I/R损伤后凋亡、炎症反应及血脑屏障的影响及可能的作用机制进行探讨,并观察L-PGDS表达变化在其中的作用,为缺血性脑卒中的治疗提供新思路。方法:第一部分:采用大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(middlecerebralarteryocclusion/reperfusion,mcao/r)模型,elisa和westernblot技术检测l-pgds在再灌注后12h,24h,3d及7d的表达变化。免疫荧光双标检测l-pgds在缺血半暗带区的表达定位。构建慢病毒shrna-l-pgds沉默l-pgds表达,采用激光共聚焦检测绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)的表达以明确慢病毒是否转染成功;采用荧光定量pcr检测慢病毒载体对大鼠脑内l-pgdsmrna的干扰效率。慢病毒转染7天后制备大鼠mcao/r模型,mcao后30min给予vns干预。实验操作过程中监测大鼠的生理参数(心率、血压及血气)以及右侧大脑中动脉(middlecerebralartery,mca)供血区脑组织血流量变化。再灌注24h时,利用westernblot和荧光定量pcr检测各组大鼠缺血半暗带区l-pgds的表达。再灌注24h后对各组大鼠进行神经功能缺失评分并测定脑梗死体积。采用tunel染色检测大鼠缺血侧皮层神经元凋亡的数量。westernblot检测凋亡通路分子(bcl-2、bax及cleavedcaspase-3)的表达变化。免疫共沉淀检测l-pgds和pparγ的相互作用。采用荧光定量pcr和westernblot检测各组大鼠缺血半暗带区pparγ的表达。第二部分:构建慢病毒shrna-l-pgds沉默l-pgds表达,慢病毒转染后7天制备大鼠mcao/r模型,mcao后30min给予vns干预。再灌注24h时,检测各组大鼠脑组织中伊文思蓝渗出量和脑组织水含量。采用westernblot检测紧密连接蛋白occludin,mmp-9及aqp4的表达。采用elisa检测缺血半暗带区肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,tnf-α)和白介素-6(interleukin6,il-6)的表达水平。结果:第一部分:(1)脑i/r损伤诱导了大鼠缺血侧皮质l-pgds的表达增加(p<0.05),这种增加的趋势一直持续到再灌注后3d,在再灌注24h时达到峰值。在缺血半暗带区皮质中,l-pgds与neun和apc存在共表达,与gfap无共表达。(2)构建的慢病毒载体可有效转染到大鼠脑组织中。与正常组和空病毒组相比,慢病毒shrna-l-pgds明显抑制了l-pgdsmrna的表达(p<0.05)。(3)在整个实验操作过程中,vns干预对大鼠的生理参数(包括平均心率、血压和血气指标)以及右侧mca供血区脑血流量改变无明显影响(p>0.05)。(4)再灌注24h时,与缺血再灌注组(i/r)相比,vns干预可进一步增强脑i/r诱导的l-pgds蛋白和mrna表达水平增加(p<0.05);慢病毒载体介导的l-pgdsshrna可有效抑制脑i/r损伤诱导的l-pgds蛋白和mrna表达水平增加(p<0.05),并减弱了vns的增强效应(p<0.05)。(5)再灌注24h时,vns可改善脑i/r损伤导致的神经功能障碍并减少脑梗死体积(p<0.05);沉默l-pgds后,进一步加重脑i/r损伤导致的脑组织损伤并削弱了vns神经保护作用(p<0.05),提示l-pgds可能参与了vns对缺血性卒中的神经保护作用。(6)与i/r组相比,vns可明显减少大鼠缺血半暗带区神经元凋亡数量(p<0.05);沉默l-pgds后,加重了脑i/r损伤诱导的神经元凋亡,并抑制了vns的抗凋亡效应(p<0.05)。(7)与假手术组相比,i/r组大鼠缺血侧皮层中凋亡蛋白bax和cleavedcaspase-3的表达明显增加(p<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2的表达明显降低(p<0.05)。与i/r组相比,vns干预后bax和cleavedcaspase-3的表达明显减少(p<0.05),bcl-2的蛋白表达明显增加(p<0.05);沉默l-pgds表达后大鼠缺血侧皮层bax和cleavedcaspase-3的表达进一步增加(p<0.05),蛋白bcl-2的表达进一步降低(p<0.05),并明显削弱vns的抗凋亡作用(p<0.05),提示l-pgds可能介导了vns对缺血性卒中的抗凋亡效应。(8)免疫共沉淀检测证实l-pgds与pparγ之间存在相互作用。(9)与假手术组相比,脑i/r损伤诱导了缺血半暗带区pparγ蛋白和mrna表达增加(p<0.05)。与i/r组相比,vns干预可进一步增强pparγ蛋白和mrna表达;沉默l-pgds表达后缺血半暗带区pparγ蛋白和mrna表达水平明显下降(p<0.05),并减弱了vns的增强效应(p<0.05)。第二部分:(1)再灌注24h时,与假手术组相比,脑i/r损伤诱导了缺血侧脑组织伊文思蓝渗出量显著增多,脑组织水含量明显增加(p<0.05)。与i/r组相比,vns减少了伊文思蓝的渗出量和脑组织的水含量(p<0.05);沉默l-pgds后,加重了脑i/r损伤诱导的伊文思蓝渗出和脑组织水含量增加(p<0.05),并削弱了vns对i/r损伤血脑屏障破坏的改善作用(p<0.05),提示l-pgds可能参与了vns对血脑屏障的保护作用。(2)与假手术组相比,i/r组大鼠缺血半暗带区aqp4和mmp-9的表达明显增加(p<0.05),occludin的表达明显降低(p<0.05)。与i/r组相比,vns干预可减少aqp4和mmp-9的表达(p<0.05),增加occludin的表达(p<0.05);沉默l-pgds后,进一步增加了脑i/r损伤诱导的aqp4和mmp-9的表达(p<0.05),进一步降低了occludin的表达(p<0.05),并减弱了vns对血脑屏障的改善作用(p<0.05),提示L-PGDS可能介导了VNS对脑I/R后血脑屏障的保护作用。(3)VNS可减轻急性脑I/R损伤诱导的炎症反应,抑制缺血侧皮质中炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达(p<0.05);沉默L-PGDS后,VNS的抗炎效果明显下降,炎症因子的表达增加(p<0.05),提示L-PGDS参与了VNS对缺血性脑卒中后炎症反应的抑制。结论:(1)VNS可减少急性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积,改善大鼠的神经功能缺失。(2)VNS干预减少急性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区神经元凋亡的数量,抑制凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,减轻了脑缺血再灌注损伤诱导的凋亡反应。(3)VNS干预减少急性脑缺血再灌注后紧密连接蛋白occludin的降解,降低MMP-9和AQP4的表达,从而达到减轻血脑屏障的损害和脑水肿的作用。(4)VNS可减轻急性脑缺血再灌注诱导的炎症反应。(5)VNS干预增加脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区L-PGDS的表达,L-PGDS表达增加可促进PPARγ表达,并在VNS对脑缺血再灌注损伤的抗凋亡、抗炎作用和血脑屏障的保护效应中发挥重要作用。