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目的p93和Nelin是近年来在构建成人心脏cDNA文库并进行新ESTs（expressed sequence tags）分离的基础上，克隆出的心脏特异表达的基因。为研究其功能，进行基因的原核蛋白表达与纯化。采用分子克隆技术，分别构建p93与Nelin的全长及缺失体片段的原核表达载体，并进行表达纯化，以获取p93与Nelin的重组蛋白。 方法（1）携带p93全长的GST融合表达载体pGEX-5X-p93转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导，产物分别用谷胱甘肽琼脂糖层析柱和电泳切胶分离纯化。（2）设计带有Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切位点的引物，以已构建好的质粒pGEX-5X-p93为模板，用PCR分别扩增出p93全长及p93的激酶与丝氨酸结构域的C端1 200bp的片段（后者简称为p93-C），并用Nco Ⅰ／Xho Ⅰ酶切PCR产物和原核表达载体pET28a（+），用T4 DNA连接酶分别将其连接，得到重组表达质粒载体pET28a-p93和pET28a-p93-C。质粒经双酶切鉴定和测序验证。重组表达质粒pET28a-p93和pETF28a-p93-C转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，SDS-PAGE进行分析，产物用Ni2+金属螯合吸附层析柱纯化。（3）采用Western杂交的方法用抗GST多克隆抗体验证GST-p93蛋白，用抗GST-p93多克隆抗体验证p93-his6和p93-C-his6蛋白。（4）Nelin基因的蛋白质预测分析。用Kyte-Doolittle方案预测蛋白质的亲水性，Emini方案预测蛋白质的表面可及性，Welling方案预测蛋白质的抗原性，Karplus-Schulz标准分析肽链柔性，经综合分析以预测Nelin基因的B细胞表位。（5）根据B细胞表位，结合同源比，以Nelin基因所包含的F-actin结合结构域和Ig结构域为划分区段标志，设计3个Nelin基因的缺失体片段：Nelin-1,1-133aa;Nelin-2,66-252 aa;Nelin-3,227-448aa。其中Nelin-2含有F-actin结合结构域，Nelin-3含有Ig结构域。（6）利用基因重组技术构建GST融合的原核表达载体pGEX-5X／Nelin1～3，和C端带有his6纯化标签的载体pET28a-Nelin-Ⅰ。转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导，SDS-PAGE分析，Western杂交验证。 结果（1）GST-p93蛋白获得了高效表达，并主要以包涵体形式存在，谷胱甘廷边大毋硕士研究生学位论文肤琼脂糖层析柱纯化后杂蛋白较多，电泳切胶分离纯化得到了纯度在95%以上的GsT-p93蛋白。（2）成功构建了pET28a-p93和pET28a一p93一C原核表达载体。P93一c一his。与p93一his6融合蛋白亦均以包涵体形式存在。用镍离子困iz+)金属鳌合吸附层析柱纯化得到了纯度在95%以上的p93一his6和p93一C一his6蛋白。经Bradford法测定，100ml菌液诱导后可得到o.smg纯化的p93一his6蛋白或Zmg纯化的p93一C一his6蛋白。（3）Western杂交检测后确认pGEX一SX一p93、pET28a一p93和pET28a一P93一C的表达产物均为正确产物。（4） Nelin基因氨基酸序列N端的2739区段、90一102区段、158一170区段可能为B细胞优势表位区域。（5）Nelin一l在pGEX和pET两套表达系统中均有较高水平表达，nelin一2表达较低，nelin一3表达水平极低。选择带有his6标签的nehn一!作为纯化对象，经Ni2+金属鳌合层析纯化，得到了nelin一1一his6蛋白，纯度在95%以上。 结论重组GST-p93与Nelin一卜his6蛋白的成功纯化使P93与Nelin的多抗和单抗制备得以完成，p93的激酶与丝氨酸结构域的C端片段在大肠杆菌中的表达与纯化，为其复性研究以及进一步的结构和功能研究提供了条件。