核仁蛋白(nucleolar protein 12，NOL12)是一种定位于核仁内的核糖体RNA结合蛋白，在脊柱动物中高度保守，参与核糖体的生物发生以及对基因组稳定性的维持。近期研究发现，下调NOL12的蛋白水平能够引起多种细胞的凋亡。我们前期工作也发现：在紫外线诱导人视网膜母细胞瘤细胞(WERI-Rb-1)的凋亡过程中，NOL12蛋白水平显著降低，但其mRNA水平却呈现出上升趋势；过表达NOL12能够减弱紫外线所引起的WERI-Rb-1细胞凋亡。在宫颈癌组织中，NOL12在癌巢组织中的表达水平显著高于癌旁组织；过表达NOL12可以促进人宫颈癌细胞(HeLa)的增殖、迁徙和单克隆集落生成。这些现象均提示：NOL12可能是肿瘤发生和发展的一个潜在促进因子，稳定且高水平表达的NOL12可能与肿瘤细胞的增殖和存活相关。上述在紫外线诱导WERI-Rb-1细胞凋亡过程中，NOL12蛋白水平显著降低而其mRNA水平却明显上升，表明凋亡因素可能促进了NOL12的降解。各种半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase)家族成员的激活是细胞凋亡诱导的经典通路，不同的Caspase通过水解各自的特异性底物而诱导凋亡。凋亡过程中，NOL12非转录水平的蛋白降低是否与特定Caspase的作用有关尚不清楚。
　　在本研究中，我们通过裸鼠成瘤实验，首次观察了改变NOL12蛋白水平对HeLa细胞成瘤能力的影响；通过生物信息学预测、体外酶切实验及酶切位点突变等方法，对药物诱导HeLa细胞凋亡过程中NOL12的蛋白减少机制进行了解析；此外，通过亚细胞水平荧光观察及细胞活力检测实验，分析了Caspase-6依赖性的蛋白酶切对NOL12的空间定位及功能的影响。
　　1.上调NOL12促进HeLa细胞的成瘤能力为明确上调NOL12与HeLa细胞成瘤能力的关系，我们将前期工作建立的稳定过表达NOL12-GFP的HeLa细胞系(HeLa-NOL12)和稳定表达对照蛋白GFP的HeLa细胞系(HeLa-Con)分别注射到同一只裸鼠的右、左后肢外侧皮下，2周后取材分析两种细胞系的成瘤情况。结果显示：HeLa-NOL12细胞所形成的肿瘤组织在体积、重量上均显著高于由HeLa-Con细胞形成的肿瘤组织。该结果说明，高水平NOL12能够促进HeLa细胞在裸鼠的成瘤能力。
　　2.下调NOL12抑制HeLa细胞的增殖、迁徙及成瘤能力为了进一步证实NOL12水平与HeLa细胞肿瘤形成的关系，继而观察了下调NOL12表达对HeLa细胞增殖、迁徙和成瘤能力的影响。首先，用沉默人源性NOL12的真核表达质粒pLent-4in1shRNA-GFP-NOL12转染HeLa细胞后，通过抗性筛选构建了稳定沉默NOL12的HeLa细胞系——HeLa-Si-NOL12细胞；同时，利用空白对照质粒pLent-4in1shRNA-GFP构建了相应的沉默对照HeLa细胞系——HeLa-Si-con细胞。Westernblot检测显示：HeLa-Si-NOL12细胞NOL12表达水平明显低于HeLa-Si-con细胞，表明稳定沉默NOL12的HeLa细胞系构建成功。我们分别通过单克隆集落形成和划痕实验，比较分析了上述两种细胞系的增殖和迁徙能力，发现稳定沉默NOL12能够显著抑制HeLa细胞的集落生成，并使HeLa细胞的迁徙能力降低。此外，裸鼠皮下成瘤实验结果显示：HeLa-Si-NOL12细胞所形成的肿瘤组织的体积和重量均显著小于对照组HeLa-Si-con细胞。以上结果表明，下调NOL12显著抑制HeLa细胞的增殖、迁徙和成瘤能力。
　　3.NOL12在喜树碱诱导的细胞凋亡中可被Caspase酶解为了明确在细胞凋亡过程中，NOL12水平非转录性降低是否因酶切降解所致，接下来对凋亡诱导后HeLa细胞内NOL12水平是否下降和是否有NOL12降解片段产生进行了检测。在细胞凋亡诱导剂喜树碱(camptothecin，CPT)处理后的HeLa细胞中，应用抗NOL12抗体的Westernblot检测显示：激活型Caspase-3的水平显著升高，同时NOL12蛋白水平显著下降。由于所使用的抗NOL12抗体只能检测到CPT引起的NOL12水平降低，而不能检测到可能出现的NOL12切割片段，继而用抗GFP抗体对CPT处理的HeLa细胞中重组表达的NOL12-GFP进行了检测。Westernblot分析发现，在Caspase-3被激活的同时，抗GFP抗体可检测一个分子量为40kDa左右的条带，说明CPT诱导HeLa细胞凋亡时，NOL12确实经历了蛋白酶切降解过程。继而，在用CPT处理表达NOL12-GFP的HeLa细胞的同时，用Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞，结果显示Z-VAD-FMK可显著抑制能被抗GFP抗体识别的40kDa左右条带的产生。由此表明在CPT诱导的凋亡过程中，NOL12可被一种或多种Caspase酶切降解。
　　4.NOL12是Caspase-6的特异性蛋白底物利用Caspase酶切位点预测软件GraBCas对NOL12可能存在的Caspase切割位点分析表明，Caspase-3、-4、-6、-7、-8和-9等是可能的高分蛋白酶，EEAD83、DELD86和VQYD99是3个可能的高分值切割位点。为明确具体是哪种Caspase对NOL12产生切割，首先分析了Caspase-3、-4、-6、-7、-8和-9分别对原核表达纯化的GST-NOL12融合蛋白的体外酶切作用。利用抗GST抗体进行Westernblot检测显示：Caspase-6能够切割GST-NOL12融合蛋白，产生40kDa左右的切割条带，而Caspase-3、-4、-7、-8和-9对该融合蛋白均无明显切割作用。为明确Caspase-6在NOL12上的具体切割位点，我们将预测的3个高分值Caspase酶切位点进行点突变，分别获得原核表达的GST与NOL12突变体融合蛋白(GST-NOL12-D83A、GST-NOL12-D86A和GST-NOL12-D99A)，然后利用Caspase-6对点突变蛋白进行体外酶切分析，发现野生型NOL12、NOL12-D83A和NOL12-D86A均能被Caspase-6切割并产生分子量约40kDa的酶切片段，只有NOL12-D99A不能被Caspase-6酶切，证明VQYD99就是Caspase-6在NOL12上的酶切位点。
　　为了进一步明确Caspase-6是否也能在真核细胞内对NOL12产生切割，继而检测了Caspase-6特异性抑制剂Z-VEID-FMK对HeLa细胞内凋亡诱导的NOL12酶切片段产生的影响。将pGFP-NOL12转染HeLa细胞后，在CPT诱导凋亡的同时用Z-VEID-FMK特异性抑制Caspase-6活性，然后用抗GFP抗体进行Westernblot检测显示：Z-VEID-FMK能浓度依赖性抑制40kDa左右NOL12-GFP片段的产生。在分别转染表达3种点突变NOL12-GFP的HeLa细胞中，加入CPT诱导细胞凋亡后，抗GFP抗体仍能在表达NOL12-D83A-GFP和NOL12-D86A-GFP的细胞中检测到增强的40kDa条带，但在过表达NOL12-D99A-GFP的细胞中则无40kDa左右切割条带产生。由此可见，CPT诱导凋亡激活的Caspase-6也能够对真核细胞内的NOL12进行酶切，其切点为也为VQYD99。
　　5.Caspase-6对NOL12的酶切改变其细胞内空间定位和细胞毒性抑制作用特异性底物在经蛋白酶切之后，其空间定位及生物学活性往往会发生显著改变。为明确Caspase-6的酶切作用是否也会影响NOL12的定位及功能，根据D99切割位点分别构建了表达带有GFP标签的NOL12氨基端片段和羧基端片段的质粒pGFP-NOL12-1-99和pGFP-NOL12-100-213，将其和表达GFP-全长NOL12的质粒分别转染HeLa细胞后，荧光显微镜检测比较了GFP-全长NOL12和2种GFP-片段NOL12的空间定位差别。结果显示：GFP-全长NOL12只分布于细胞核内，且绝大部分集中定位于核仁，少量分布在核内直径约为1μm左右的小颗粒结构上；而NOL12-1-99-GFP和NOL12-100-213-GFP的空间定位发生显著改变，虽仍主要分布在细胞核内，但核仁内的定位显著减少，且在细胞质中存在少量弥散状分布，而细胞核内的小颗粒状定位完全消失。这种片段化的NOL12在细胞内的定位与全长NOL12的不同，表明Caspase-6在D99位点的切割也能改变NOL12的空间分布。
　　在比较Caspase-6酶切对NOL12生物学功能影响时，为了避免因GFP分子太大对NOL12酶切片段的生物学活性的影响，检测了分别转染表达全长NOL12和两种NOL12片段(NOL12-1-99和NOL12-1-99)与小分子标签HA的融合蛋白对HeLa细胞活力的影响。阿尔玛蓝染色法检测发现，过表达HA-全长NOL12增强细胞活力，而过表达HA-NOL12-1-99和HA-NOL12-100-213使细胞活力均明显减弱，尤以氨基末端片段(NOL12-1-99)减弱细胞活力的作用更为显著。由此表明，NOL12被Caspase-6切割所产生的酶切片段不仅没有细胞保护作用，反而具有细胞毒性。此外，在HeLa细胞转染表达的Caspase-6酶切位点突变的HA-NOL12-D99A，无过表达野生型NOL12对CPT诱导的细胞毒性的抑制作用。由此说明，NOL12分子中D99位点除了是Caspase-6的切割位点之外，还可能发挥更重要的生物学作用。
　　结论：NOL12蛋白表达水平影响HeLa细胞的成瘤能力，上调NOL12水平促进HeLa细胞的成瘤能力，下调NOL12水平则抑制HeLa细胞的增殖、迁徙和成瘤能力；NOL12可能是一个新的促进宫颈癌等肿瘤发生、发展的癌基因。CPT诱导细胞凋亡时，激活Caspase-6在VQYD99位点水解NOL12，导致NOL12空间分布改变，并产生具有细胞毒性的酶切片段，D99位点突变使NOL12的细胞毒性的抑制作用丧失；D99位点除了作为Caspase-6的酶切位点外，还可能为其生物学功能的维持所必需。